기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) 유전체 교정 연구단(단장 김진수) 연구팀은 새로운 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술인 ‘징크핑거 염기교정효소(ZFD, Zinc Finger Deaminase)’개발에 성공했다.

미토콘드리아는 에너지를 만들어내는 세포 내 소기관이다. 미토콘드리아 DNA에 변이가 일어나면 시력·청력 뿐 아니라 중추신경계·근육·심장 등에 치명적인 결함을 야기한다. 미토콘드리아 질환은 5,000명 중 한 명 꼴로 발생하는 비교적 흔한 유전질환이다. 그러나 현재 유전체 교정 기술로 널리 활용되는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9)¹⁾로는 미토콘드리아 DNA 교정이 불가했다. 2020년 세균 유래 DddA 탈아미노 효소와 탈이펙터 단백질을 이용한 새로운 염기교정효소 DdCBE가 개발되었다. 이는 유일한 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술이었다.

연구진은 기존의 DddA 탈아미노 효소와 징크핑거 단백질(Zinc finger protein)²⁾을 융합하여 새로운 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술인 ‘징크핑거 염기교정효소’를 개발했다. 징크핑거 단백질은 기존에 사용된 탈이펙터 단백질보다 크기가 절반 이상 작아 다양한 구조로 디자인할 수 있고 활용이 용이하다. 세포투과 능력이 있어 핵산 없이도(nucleic acid-free) 유전체 교정이 가능한 장점도 있다.

연구진은 우선 24개의 ZFD 구조 쌍을 제작하여 최적의 구조를 찾아냈다. 이어 ZFD를 이용해 핵 및 미토콘드리아 DNA의 시토신/구아닌(C/G) 염기쌍을 티민/아데닌(T/A)으로 치환하는 데 성공했다. 개발한 ZFD나 ZFD-DdCBE 하이브리드(ZFD-DdCBE hybrid)를 사용하면, 기존의 DdCBE만으로는 만들 수 없었던 변이를 다양하게 유도할 수 있다. 나아가 징크핑거 단백질을 개량하거나 전달 형태에 변화를 줌으로써 비표적 효과(off-target)³⁾를 개선하여 정확성을 획기적으로 높였다.

김진수 단장은 “앞으로 미토콘드리아 질환을 비롯한 난치병 연구 및 치료 뿐 아니라 식물의 엽록체 DNA 등 다른 소기관의 DNA 교정에도 다양하게 활용될 것”이라며 “ZFD는 작은 크기 덕분에 세포 전달에 많은 이점이 있는 만큼 여러 기술들과 접목하여 활용도가 클 것으로 기대된다”고 전했다.

이번 연구결과는 생물학 분야의 세계적 학술지인 네이처 커뮤니케이션즈 (Nature communications, IF 14.919) 1월 18일자 온라인 판에 게재되었다.

그림설명

[그림1] ZFD 구조 최적화

(왼쪽 그림) ZFD는 한쌍으로 제작하여 사용할 수 있다. 가장 효율적으로 작동하는 ZFD의 구조를 찾기 위하여, 1) 분할 시토신 탈아미노효소(split DddA)의 분할 위치, 2) 분할 시토신 탈아미노효소와 징크핑거 어레이의 간의 연결의 방향성, 3) 시토신 탈아미노효소와 징크핑거 어레이를 연결할 때 사용하는 linker의 길이를 다양하게 구성한 24개의 ZFD 구조 쌍을 제작하였다. (오른쪽 그림) 개별 ZFD 구조 쌍에 따라 도입된 염기 교정 효율을 조사하여 효율이 높은 ZFD의 구조적 조건을 결정할 수 있었다.

[그림2] 세포 내 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정

세포 내 핵 및 미토콘드리아 DNA를 표적으로 하는 다양한 ZFD 쌍을 제작하였다. ZFD는 CC구조와 NC구조로 디자인 할 수 있어서 다양한 구조적 방향성으로 제작할 수 있다는 장점이 있다. ZFD는 핵 DNA에서 최대 60%, 미토콘드리아 DNA에서 최대 30%의 효율로 시토신/구아닌(C/G) 염기쌍을 티민/아데닌(T/A)으로 치환할 수 있음을 확인하였다.

[그림3] ZFD-DdCBE 하이브리드

미토콘드리아 DNA의 비슷한 부위를 표적으로 하는 ZFD(파란색)와 DdCBE(초록색)를 따로 또는 함께 사용해 유도된 염기 편집의 패턴을 살펴보았다. 기존의 DdCBE와 비교했을 때, ZFD나 ZFD-DdCBE 하이브리드(ZFD-DdCBE hybrid)는 다른 위치와 범위에서 염기치환을 일으키는 것을 관찰하였다. ZFD를 사용하면 이전에는 만들 수 없던 염기 편집 패턴을 만들 수 있다는 의미다.

1) 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9) : 가이드 RNA를 이용, Cas9 단백질이 교정할 목표 DNA를 인식할 수 있도록 한다. 이 방법은 세포 핵 속의 DNA에는 잘 작동하지만, 가이드 RNA가 미토콘드리아 막을 통과하지 못해 미토콘드리아 DNA 교정에는 적용할 수 없다.

2) 징크핑거 단백질(Zinc finger protein) : 징크핑거는 아연 이온(zinc ions, Zn2+)을 포함하여 손가락 모양으로 DNA에 결합할 수 있는 단백질 구조 모티프이다. 특정 DNA 서열을 인식하는 징크핑거들을 여러 개(최소 3개)를 연결하여 징크핑거 단백질을 만든다.

3) 비표적 효과(off-target) : 본래 목표가 아닌 다른 부위에서 유전자가 발현하는 부작용.