발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존 유전공학 도구 한계: 분자생물학 연구의 핵심 도구인 제한효소는 거대한 게놈(genome) 크기의 DNA를 정교하게 다루는 데 한계가 있었습니다.

• 인공 뉴클레아제 개발: 이러한 한계를 극복하기 위해 징크핑거 뉴클레아제(ZFNs), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALENs)와 같은 인공 효소가 개발되었습니다.

• 3세대 유전자 가위의 등장: 최근 미생물의 면역체계에서 유래한 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 3세대 유전자 가위(RGEN)가 개발되어 생명공학 분야에 혁신을 가져왔습니다.

• 핵심적 문제점: 하지만 CRISPR 시스템의 핵심 단백질인 Cas9은 유전자의 크기가 너무 커서, 치료 유전자를 세포에 전달하는 운반체로 널리 쓰이는 바이러스 벡터(viral vector)에 탑재하기 어렵습니다. 이로 인해 바이러스 생산 효율과 세포 내 전달 효율이 크게 떨어지는 문제가 발생합니다.

기술의 필요성

• Cas9 단백질의 크기 문제 해결: Cas9 단백질을 효율적으로 세포 내로 전달하기 위해 바이러스 벡터의 패키징 한계를 극복할 새로운 기술이 필요합니다.

• 유전자 치료 효율 증대: Cas9 단백질의 전달 효율을 높여, 다양한 유전 질환 치료제의 개발 가능성을 넓히고 치료 효과를 극대화할 필요가 있습니다.

구현 방법

기술의 원리

• Cas9 단백질 분할: 본 발명은 크기가 큰 Cas9 단백질을 바이러스 벡터에 탑재 가능한 크기의 두 개의 작은 도메인(N-말단, C-말단)으로 분리하는 아이디어에서 출발합니다.

• 개별 벡터 패키징: 분리된 각 도메인을 서로 다른 두 개의 재조합 바이러스 벡터에 각각 나누어 패키징합니다.

• 세포 내 재조합 및 기능 회복: 두 벡터를 동시에 세포에 도입하면, 세포 내에서 각각 발현된 두 도메인이 다시 하나의 완전한 Cas9 단백질로 융합되어 본래의 유전자 편집 기능을 수행합니다. 본 발명에서는 이를 ‘Split-Cas9’이라 명명하였습니다.

구체적인 구현 방법

1. 도메인 분리 및 벡터 제작: Cas9 단백질의 중간 부위를 절단하여 N-말단(제1 도메인, 약 2.1kbp)과 C-말단(제2 도메인, 약 1.9kbp)으로 구성된 두 개의 하프 도메인을 제작합니다.

2. 독립 발현 시스템 구축: 각 하프 도메인이 독립적으로 발현될 수 있도록 각각의 재조합 벡터(예: 플라스미드, 아데노부속바이러스 벡터)에 삽입합니다. 이때, 발현 및 핵 내 이동을 돕기 위해 NLS(핵 위치 신호), HA-태그 등의 서열을 추가할 수 있습니다.

3. 세포 내 동시 도입: 제작된 두 개의 재조합 벡터를 표적 유전자에 대한 가이드 RNA(sgRNA)와 함께 세포(예: Hela 세포) 내로 동시에 도입합니다.

4. 기능 활성화: 세포 내에서 발현 및 융합된 Split-Cas9 단백질은 sgRNA의 안내에 따라 표적 유전자를 찾아가 DNA 이중나선 절단(DSB)을 유도하여 유전자 교정을 수행합니다.

기술의 장점

• 전달 효율성 증대: Cas9 단백질을 두 개로 분할하여 바이러스 벡터의 패키징 한계를 극복함으로써, 세포 내로의 전달 효율을 획기적으로 증가시킵니다.

• 표적 특이성 및 안전성 향상: 실험 결과, Split-Cas9은 기존 야생형 Cas9 대비 표적 특이성이 최대 220배까지 현저히 증가하는 것으로 확인되었습니다. 이는 원치 않는 유전자를 편집하는 비표적 효과(Off-target effect)를 최소화하여 유전자 치료의 안전성을 크게 높입니다.

• 넓은 적용 범위: 본 기술은 세포의 종류나 Cas9 단백질의 종류에 구애받지 않고 적용 가능하여, 다양한 질병에 대한 유전자 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 주요 목적은 Cas9 단백질의 큰 크기로 인한 바이러스 벡터 전달의 한계를 극복하는 새로운 시스템을 개발하고, 분리된 Cas9 도메인이 세포 내에서 재결합하여 정상적인 유전자 편집 기능을 수행하는지 검증하는 것입니다. 더 나아가, 개발된 'Split-Cas9' 시스템의 유전자 편집 효율성과 표적 특이성을 정량적으로 분석하여 기존 기술 대비 개선점을 확인하고자 하였습니다.

실험 방법 및 과정

1. Split-Cas9 벡터 제작: 야생형 Cas9 단백질을 N-말단과 C-말단 하프 도메인으로 분리하고, 각각을 독립된 재조합 벡터에 클로닝하였습니다.

2. 세포 내 도입 및 발현: 제작된 두 벡터와 특정 유전자(HPRT, DMD, CCR5)를 표적하는 sgRNA를 Hela 세포에 함께 도입하여 Split-Cas9의 발현을 유도하였습니다.

3. 유전자 편집 효율 분석: T7E1 분석 및 차세대 염기서열 분석(Next-generation sequencing)을 통해 표적 유전자 부위에서 삽입/결실(Indel) 돌연변이가 유도되었는지 확인하고, 그 효율을 정량적으로 측정하였습니다.

4. 표적 특이성 분석: Hela 및 Hep1 세포에서 표적 위치(On-target)와 비표적 위치(Off-target)에서의 유전자 변이 효율을 비교 분석하여, Split-Cas9이 야생형 Cas9에 비해 얼마나 특이성이 향상되었는지 평가하였습니다.

5. 바이러스 벡터 시스템 검증: 아데노부속바이러스(AAV) 벡터를 이용한 Split-Cas9 전달 시스템을 구축하고, 바이러스 감염을 통해 세포 내에서 효과적으로 유전자 편집이 일어나는지 검증하였습니다.

실험 결과

실험 결과, Split-Cas9 시스템은 다양한 표적 유전자에 대해 성공적으로 Indel을 유도했으며, 특히 안전성의 척도인 표적 특이성에서 기존 기술 대비 월등한 성능을 보였습니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 유전자 치료제 개발: 안전성과 전달 효율이 높아, 겸상 적혈구 빈혈증, 뒤센 근이영양증(DMD) 등 다양한 유전 질환에 대한 유전자 치료제 개발에 핵심적인 벡터 시스템으로 활용될 수 있습니다.

• 세포 치료제 개발: 체세포, 줄기세포, 면역세포(CAR-T) 등의 유전자를 교정하여 효능이나 안전성이 개선된 세포 치료제 개발에 적용할 수 있습니다.

• 신약 개발 플랫폼: 특정 유전자를 편집한 질환 모델 세포 및 동물을 제작하여 신약 후보물질의 효능을 평가하는 플랫폼 기술로 활용 가능합니다.

기대효과

• 안전성 높은 유전자 치료: 비표적 효과를 최소화함으로써 유전자 치료의 안전성을 획기적으로 개선하여 부작용 위험을 줄일 수 있습니다.

• 치료 범위 확대: 기존 바이러스 벡터로 전달이 어려웠던 다양한 조직 및 장기를 표적하는 유전자 치료제 개발이 가능해져 미충족 의료 수요(unmet medical needs)를 해결하는 데 기여할 수 있습니다.

• 기술 경쟁력 확보: 차세대 유전자 가위 전달 기술의 원천 특허를 확보함으로써, 급성장하는 글로벌 유전자 편집 시장에서 기술적 우위와 시장 선점 효과를 기대할 수 있습니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR 기술을 중심으로 한 글로벌 유전자 편집 시장은 폭발적인 성장을 거듭하고 있습니다. BCC Research에 따르면, CRISPR 기술 시장은 2022년 33억 달러에서 연평균 22.3% 성장하여 2027년에는 92억 달러 규모에 이를 것으로 전망됩니다. (출처)

• 2024년 80억 4천만 달러에서 2032년 299억 3천만 달러 규모로 성장 (연평균 15.7%) 예상 (출처)

• 2023년 약 50억 달러에서 2028년 100억 달러 돌파 (연평균 15%) 전망 (출처)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

CRISPR 기술 시장은 원천 특허를 보유한 소수의 연구기관과 이를 기반으로 치료제를 개발하는 다수의 바이오 기업들 간의 협력 및 경쟁 구도로 이루어져 있습니다. CRISPR-Cas9 기술은 2022년 기준 전체 시장의 63.8%를 차지하며 압도적인 점유율을 보이고 있습니다. (출처)

산업 동인 및 기회 요인

1. 최초의 CRISPR 치료제 승인: 2023년 말, 낫형 적혈구 빈혈증 치료제 '카스게비(Casgevy)'가 세계 최초의 CRISPR 기반 유전자 편집 치료제로 승인되면서 기술의 상업적 가치를 입증하고 시장 성장을 가속화하고 있습니다. (출처)

2. R&D 투자 및 협력 증가: 유전자 편집 기술의 잠재력에 주목한 글로벌 제약사들과 벤처 캐피털의 투자가 급증하고 있으며, 기술 라이선싱 및 공동 연구개발이 활발하게 이루어지고 있습니다.

3. 응용 분야의 확장: 기존의 유전질환 치료를 넘어 항암 치료제, 감염성 질환 예방, 농작물 및 가축 품종 개량, 신약 개발 등 광범위한 분야로 기술 적용이 확대되고 있습니다. (출처)

4. 안전성 문제 해결 노력: 본 'Split-Cas9' 기술과 같이 비표적 효과를 줄여 안전성을 높이는 차세대 기술 개발은 유전자 편집 기술의 임상 적용을 앞당기는 핵심 동력으로 작용할 것입니다.