발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존의 유전공학 도구인 메가뉴클레아제, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFNs), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALENs) 등은 유전자 변이, 삽입, 재배열을 가능하게 하는 강력한 도구였습니다.

• 최근 3세대 유전자 가위로 불리는 CRISPR/Cas 시스템이 개발되어 생명공학 분야에 혁신을 가져왔습니다. 이 시스템의 핵심 단백질인 Cas9은 특정 DNA 서열을 인식하고 절단하여 유전자 교정을 유도합니다.

• 하지만 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자는 크기가 매우 커서, 유전자 전달에 널리 사용되는 바이러스 벡터에 탑재하기 어렵다는 본질적인 한계가 있었습니다. 이는 바이러스 생산 효율과 세포 내 전달 효율을 크게 떨어뜨리는 문제로 작용했습니다.

기술의 필요성

• Cas9 단백질의 큰 크기 문제를 해결하고, 효율적인 유전자 전달을 위해 바이러스 벡터를 활용할 수 있는 새로운 시스템 개발이 시급했습니다.

• 전달 효율을 높여 다양한 세포와 생물체에서 유전자 교정 기술의 활용 범위를 넓히고, 관련 치료제 및 기술 개발을 가속화할 필요성이 대두되었습니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 거대한 Cas9 단백질을 바이러스 벡터에 패키징 가능한 크기의 두 개의 작은 도메인(하프 도메인)으로 분리하는 아이디어에서 출발합니다. 이 분리된 Cas9을 'split-Cas9'이라 명명합니다.

• Cas9의 N-말단을 포함하는 '제1 도메인'과 C-말단을 포함하는 '제2 도메인'을 각각 별도의 재조합 벡터(예: 바이러스 벡터)에 삽입하여 제작합니다.

• 이 두 개의 벡터를 세포 내에 동시에 도입하면, 각각의 벡터에서 발현된 두 도메인이 세포 내에서 다시 결합하여 온전한 기능을 가진 Cas9 단백질을 형성합니다.

• 재조립된 Cas9 단백질은 가이드 RNA(sgRNA)와 함께 표적 DNA 서열로 이동하여 유전자 절단 및 교정(Indel 유도)을 수행합니다.

구체적인 구현 방법

1. 야생형 Cas9 단백질의 중간 부위에 존재하는 링커(linker) 서열을 절단하여 두 개의 하프 도메인을 제작합니다.

2. 제1 도메인(N-말단)과 제2 도메인(C-말단)을 각각 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 제작합니다. 각 벡터는 독립적인 발현을 위해 CMV 같은 프로모터를 포함합니다.

3. 핵 내 전달 및 단백질 발현 확인을 위해 각 도메인에 NLS(nuclear localization signal) 및 HA 태그(tag) 서열을 추가합니다.

4. 바이러스 벡터 적용 시, 제1 도메인에는 스플라이싱 도너(splicing donor)를, 제2 도메인에는 스플라이싱 억셉터(splicing acceptor)를 연결하여 세포 내에서 두 단백질이 효과적으로 융합되도록 설계합니다.

기술의 장점

• 바이러스 벡터 패키징 한계 극복: Cas9 유전자를 두 개로 나누어 AAV(아데노부속바이러스)와 같은 작은 용량의 바이러스 벡터에도 탑재할 수 있어 전달 효율을 크게 높입니다.

• 향상된 표적 특이성: 실험 결과, split-Cas9은 기존 야생형 Cas9에 비해 표적 특이성이 최대 80배에서 220배까지 증가하는 것으로 확인되었습니다. 이는 원치 않는 곳을 편집하는 비표적 효과(off-target effect)를 최소화하여 기술의 안전성을 높입니다.

• 높은 활용성: 세포 종류나 Cas9 단백질 종류에 구애받지 않고 적용 가능하여 유전자 치료제, 신약 개발, 기초 연구 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 실험은 분리된 두 개의 도메인으로 구성된 'split-Cas9' 시스템이 실제로 세포 내에서 재조립되어 온전한 Cas9 단백질로서의 기능을 수행하는지, 즉 표적 유전자에 대해 효과적으로 변이(Indel)를 유도할 수 있는지 검증하는 것을 주된 목적으로 하였습니다. 또한, 야생형 Cas9과 비교하여 표적 특이성이 개선되었는지 확인하고, 최종적으로 바이러스 벡터를 이용한 전달 시스템에서도 기능이 유효한지 평가하고자 하였습니다.

실험 방법 및 과정

1. Split-Cas9 벡터 제작: 야생형 Cas9을 절단하여 제1 도메인과 제2 도메인을 각각 발현하는 플라스미드 벡터 및 아데노부속바이러스(AAV) 벡터를 제작했습니다.

2. 세포 내 도입 및 변이 유도 확인: 제작된 두 개의 벡터를 Hela 세포에 도입하고, 표적 유전자(CCR5, HPRT, DMD)에 대한 sgRNA를 함께 처리한 후 T7E1 분석 및 차세대 염기서열 분석(NGS)을 통해 Indel 발생 여부와 효율을 측정했습니다.

3. 표적 특이성 분석: Hela 및 Hep1 세포에서 split-Cas9과 야생형 Cas9의 표적 위치(on-target) 및 비표적 위치(off-target)에서의 변이 효율을 비교 분석하여 특이성을 평가했습니다.

4. 바이러스 벡터 기능 검증: Split-Cas9 도메인을 각각 패키징한 AAV 바이러스를 Hela 세포에 감염시킨 후, 시간에 따른(5, 7, 10일) 표적 유전자 절단율을 분석했습니다.

실험 결과

실험 결과, split-Cas9 시스템은 세포 내에서 성공적으로 기능하여 다양한 표적 유전자에 변이를 유도했으며, 기존 Cas9 대비 안전성이 크게 향상되었습니다. 주요 결과는 다음과 같습니다.

1. 표적 유전자 변이 효율: 차세대 염기서열 분석 결과, split-Cas9은 HPRT 유전자에서 27.1%, DMD 유전자에서 23.75%, CCR5 유전자에서 20.27%의 높은 Indel 효율을 보였습니다. 이는 분리된 도메인이 세포 내에서 성공적으로 융합하여 기능함을 입증합니다.

2. 표적 특이성 향상: Hela 세포와 Hep1 세포에서 실험한 결과, split-Cas9의 특이성은 야생형 Cas9 대비 각각 최대 220배, 80배 증가했습니다. 이는 비표적 효과를 획기적으로 줄여 유전자 편집의 정확성과 안전성을 높였음을 의미합니다.

3. 바이러스 벡터 시스템에서의 기능: AAV 벡터를 통해 전달된 split-Cas9은 세포 감염 10일 후 약 5%의 표적 서열 절단 효과를 나타냈습니다. 이는 바이러스 벡터를 이용한 생체 내(in vivo) 적용 가능성을 시사하는 중요한 결과입니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 유전자 치료제 개발: AAV와 같은 안전성이 입증된 바이러스 벡터를 활용하여 다양한 유전 질환에 대한 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료제 개발에 직접적으로 적용할 수 있습니다.

• 신약 개발 및 질병 모델 제작: 특정 유전자가 변형된 세포주 또는 동물 모델을 효율적으로 제작하여 신약 후보물질의 효능을 평가하거나 질병의 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

• 유전자 발현 조절용 키트: 제1, 제2 도메인을 발현하는 재조합 벡터와 가이드 RNA를 포함하는 키트 형태로 제작하여 연구자들에게 간편하고 효율적인 유전자 편집 도구를 제공할 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: Cas9의 바이러스 벡터 전달 효율 문제를 해결함으로써 CRISPR 유전자 가위 기술의 상용화를 앞당기고, 기존에 접근하기 어려웠던 다양한 조직 및 장기에 대한 유전자 편집 기술 적용을 가능하게 합니다.

• 경제적/산업적 효과: 안전성과 효율성이 향상된 유전자 편집 기술을 통해 고부가가치 유전자 치료제 시장을 선점하고, 정밀 의료 및 맞춤형 치료 분야의 성장을 견인할 것으로 기대됩니다.

• 안전성 증대: 획기적으로 감소된 비표적 효과는 유전자 치료의 잠재적 부작용에 대한 우려를 줄여, 임상 적용 가능성을 높이고 기술의 신뢰도를 확보하는 데 기여합니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR 기술을 이용한 유전자 편집 시장은 폭발적인 성장을 거듭하고 있습니다. BCC Research 보고서에 따르면, 글로벌 시장은 2022년 33억 달러 규모에서 연평균 22.3%의 성장률을 보이며 2027년에는 92억 달러에 이를 것으로 전망됩니다. (출처: 툴젠(199800) 보고서) 이러한 성장은 유전자 치료제 개발의 가속화와 다양한 산업 분야로의 기술 응용 확대에 기인합니다.

• 최초의 CRISPR 치료제 '카스게비(Casgevy)'가 미국 FDA 승인을 받으며 기술의 상업화 시대가 본격적으로 개막했습니다.

• NGS 기술 발달로 개인 유전체 분석 비용이 1,000달러 미만으로 하락하면서, 개인 맞춤형 정밀 의료 시장이 2020년 이후 약 950조원 규모로 성장할 것으로 예상됩니다. (출처: 한국연구재단)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

유전체 시장은 소수의 글로벌 기업들이 높은 점유율을 차지하고 있습니다. CRISPR 기술 시장의 경우, 원천 특허를 보유한 연구기관 및 이들로부터 기술을 이전받은 기업들이 시장을 주도하고 있습니다. (출처: 한국연구재단, 툴젠(199800) 보고서)

글로벌 유전체 시장 주요 기업 점유율

산업 동인 및 기회 요인

1. 치료제 상용화: 세계 최초 CRISPR 치료제의 FDA 승인은 후속 유전자 치료제 개발에 대한 기대를 높이고 관련 투자를 촉진하는 강력한 동인입니다.

2. 기술 응용 분야 확대: 치료제뿐만 아니라 농업(종자 개발), 축산업, 기초 연구, 멸종 동물 복원 등 다양한 분야로 기술이 확장되면서 새로운 시장이 창출되고 있습니다.

3. 규제 환경 변화: 미국, 일본 등 일부 국가에서 유전자 편집 식물을 GMO 규제 대상에서 제외하는 등 규제 완화 움직임이 시장 성장을 가속화할 기회 요인으로 작용합니다. (출처: 툴젠(199800) 보고서)