발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 리보핵산단백질(RNP)을 세포에 직접 전달하는 방식은 기존 DNA 전달 방식의 문제점(유전체 삽입, cGAS 활성화)을 해결할 수 있는 대안으로 주목받고 있습니다.

• RNP는 세포 내에서 즉시 작용하고 24시간 내에 분해되어 표적 외 효과(off-target effect)를 줄이는 장점이 있습니다.

• 하지만, 기존의 in vitro transcription 방식으로 제조된 가이드 RNA는 5' 말단에 트리포스페이트(5'-PPP)를 가지고 있어, 이것이 인체 내에서 면역 반응을 유발하고 세포 독성을 나타내는 문제점이 있습니다.

기술의 필요성

• 유전자 가위 기술을 이용한 치료제의 안전성과 효율성을 높이기 위해, RNP 전달 시 발생하는 면역 반응 및 세포 독성 문제를 해결하는 기술 개발이 시급합니다.

• 부작용을 최소화하여 RNP 기반 유전자 치료제가 더욱 다양한 질병에 효과적으로 적용될 수 있도록 하는 새로운 접근법이 필요합니다.

구현 방법

기술의 원리

본 기술은 유전자 가위(RGEN) RNP를 구성하는 가이드 RNA의 5' 말단에 존재하는 인산기(트리포스페이트 또는 다이포스페이트)를 제거하는 것을 핵심 원리로 합니다. 이 인산기는 인체 내에서 외부 물질로 인식되어 면역 반응을 유발하는 주된 원인입니다. 따라서 이를 제거함으로써 RNP 전달 과정에서 발생하는 면역 반응과 세포 독성을 근본적으로 억제 및 완화시킬 수 있습니다.

구체적인 구현 방법

1. 인산기 제거: T7 RNA 폴리머라아제 등을 이용한 in vitro 전사 방식으로 제작된 가이드 RNA에 포스파타아제(Phosphatase) 효소(예: CIP, SAP)를 처리하여 5' 말단의 트리포스페이트 및 다이포스페이트를 제거합니다.

2. 화학적 합성: 처음부터 5' 말단에 인산-인산 결합이 없는 형태로 가이드 RNA(crRNA 또는 sgRNA)를 화학적으로 합성하여 사용합니다.

3. RNP 복합체 형성: 위 방법으로 준비된 '인산기 제거 가이드 RNA'를 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 혼합하여, 면역 반응 유도능 및 세포 독성이 감소된 RNP 복합체를 제조합니다.

기술의 장점

• 면역 반응 억제: 기존 방식 대비 면역 반응 관련 유전자(IFN-β, RIG-I) 발현을 약 100배, OAS2 유전자 발현을 약 10,000배 가량 억제하여 면역 부작용을 최소화합니다.

• 세포 독성 감소: 불필요한 면역 반응을 막아 세포 사멸을 방지하고 세포 생존율(cell viability)을 현저히 향상시킵니다.

• 높은 유전자 편집 효율 유지: 안전성을 높이는 동시에, 기존 방식과 유사한 수준의 높은 유전자 편집 효율을 유지하여 기술의 치료적 가치를 보존합니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 실험의 목적은 5' 말단의 인산기가 제거된 가이드 RNA를 사용한 RNP 전달 방식이 실제로 면역 반응과 세포 독성을 줄이는지, 그리고 이 과정에서 유전자 편집 효율이 저하되지 않는지를 정량적으로 검증하는 것입니다.

실험 방법 및 과정

1. 가이드 RNA 준비: 세 가지 유형의 가이드 RNA (①화학 합성, ②CIP 처리, ③처리하지 않은 in-vitro 전사 RNA)를 준비했습니다.

2. RNP 전달: 준비된 각 가이드 RNA를 Cas9 또는 Cpf1 단백질과 혼합하여 RNP 복합체를 만든 후, 인간 HeLa 세포주에 전달(transfection)했습니다.

3. 결과 측정: 세포 전달 후 일정 시간이 지난 뒤, RT-qPCR로 면역 반응 관련 유전자의 mRNA 발현량, ELISA로 IFN-β 단백질 분비량, WST 분석으로 세포 생존율, 그리고 차세대 염기서열 분석(NGS) 또는 T7E1 분석으로 유전자 편집 효율(Indel %)을 각각 측정했습니다.

실험 결과

실험 결과, 5' 말단 인산기를 제거한 가이드 RNA(화학 합성 또는 CIP 처리)를 사용했을 때 면역 반응과 세포 독성이 현저히 감소했으며, 유전자 편집 효율은 기존 방식과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인했습니다. 상세한 비교 결과는 아래 표와 같습니다.

Cas9 및 Cpf1 단백질을 이용한 RNP 전달 실험 결과 비교

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 안전성이 강화된 유전자 치료제 개발: 유전성 희귀질환, 난치성 암, 바이러스 감염 질환 등 다양한 질병에 대한 안전하고 효과적인 유전자 교정 치료제 개발에 직접적으로 활용될 수 있습니다.

• 기초 연구 및 신약 개발 도구: 부작용 없이 정밀한 유전자 편집이 가능해져, 질환 동물 모델 제작이나 신약 타겟 검증 등 기초 연구 분야에서 신뢰도 높은 도구로 사용될 수 있습니다.

• 농축산업 분야 적용: 생산성과 기능성이 향상된 맞춤형 종자나 가축을 개발하는 육종 기술에 적용하여 식량 문제 해결에 기여할 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: CRISPR 유전자 가위 기술의 임상 적용을 가로막던 핵심적인 안전성 문제를 해결함으로써, 관련 기술의 상용화를 앞당기고 차세대 유전자 치료 기술의 표준을 제시할 것으로 기대됩니다.

• 경제적 파급효과: 부작용이 감소된 치료제 개발은 환자의 치료 비용 부담을 줄이고, 고부가가치 바이오 의약품 시장에서 글로벌 기술 경쟁력을 확보하는 데 기여할 것입니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR 기술을 중심으로 한 글로벌 유전자 편집 및 RNA 치료제 시장은 매우 빠른 속도로 성장하고 있습니다. 다양한 시장 분석 기관들은 높은 연평균 성장률을 예측하며, 기술의 적용 분야가 확대됨에 따라 시장 규모가 더욱 커질 것으로 전망하고 있습니다.

• 글로벌 유전자 편집 시장은 2023년 80.4억 달러에서 연평균 15.7% 성장하여 2032년에는 299.3억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. (출처)

• BCC Research는 유전자 편집 시장이 2022년 33억 달러에서 연평균 22.3% 성장하여 2027년 92억 달러 규모에 이를 것으로 전망했습니다. (출처)

• RNA 치료제 분야에서는 2025년 첫 siRNA 블록버스터가 등장하고, 2030년까지 총 11개 제품이 블록버스터 지위에 오를 것으로 예측됩니다. (출처)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

CRISPR 유전자 가위 시장은 3세대 기술인 CRISPR/Cas9을 중심으로 활발한 연구개발이 이루어지고 있습니다. 기술의 잠재력이 큰 만큼, 기술 특허를 둘러싼 경쟁과 안전성, 윤리적 문제 등 다양한 이슈가 공존하고 있습니다.

산업 동인 및 기회 요인

1. 기술의 혁신성: 3세대 유전자 가위인 CRISPR/Cas9은 기존 기술 대비 제작이 쉽고, 유전자 선정에 유연하며, 사용이 간편하여 R&D 생산성을 크게 향상시키며 시장 성장을 견인하고 있습니다. (출처)

2. 적응증 확장: 초기에는 희귀질환 중심이었으나, 고지혈증, 심혈관 질환, 비만 등 만성 질환으로 RNA 치료제의 적용 범위가 확대되면서 새로운 시장 기회가 창출되고 있습니다. (출처)

3. 규제 환경 변화: 미국 USDA가 CRISPR 기술로 만든 농작물을 GMO 규제 대상에서 제외하는 등, 외부 DNA가 삽입되지 않은 유전자 편집 기술에 대한 규제가 완화되는 추세는 산업 성장에 긍정적인 영향을 미치고 있습니다. (출처)