발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존 유전체 교정 기술은 특정 유전자를 표적하기 위해 많은 시간과 노력이 소요되며, 각기 다른 시약(reagent)을 제작해야 하는 어려움이 있었습니다.

• 널리 사용되는 CRISPR-Cas9 시스템은 표적 DNA가 특정 PAM 서열(NGG)을 가져야만 작동하며, DNA를 평활 말단(blunt end)으로 절단하여 유전자를 삽입(knock-in)하는 효율이 낮다는 한계가 있었습니다.

• 배아에 유전물질을 주입하는 기존의 미세주입법(microinjection)은 한 번에 하나의 배아만 처리할 수 있어 시간이 많이 소요되고, 배아의 생존 단계(1 cell stage)가 짧아 기술적 장애가 되었습니다.

기술의 필요성

• 기존 CRISPR-Cas9 시스템의 한계를 극복하고, 보다 효율적이고 정확한 새로운 유전자 교정 기술 개발이 시급합니다.

• 다수의 세포나 배아에 유전물질을 효과적으로 전달할 수 있는 새로운 전달 기술의 개발이 요구됩니다.

구현 방법

기술의 원리

본 발명은 기존 Type II CRISPR-Cas9 시스템의 단점을 보완하는 Type V CRISPR-Cpf1 시스템을 이용한 유전체 교정 기술입니다. Cpf1 단백질은 Cas9과 유사하게 가이드 RNA(crRNA)와 결합하여 표적 유전자를 절단하지만, 작동 방식에서 중요한 차이점을 가집니다.

• 단일 가이드 RNA 사용: Cpf1 단백질은 하나의 crRNA만으로 작동하여, Cas9처럼 두 종류의 RNA(crRNA, tracrRNA)를 사용하거나 인위적으로 합친 sgRNA를 제작할 필요가 없어 더 간편합니다.

• 새로운 PAM 서열 인식: Cas9과 달리 표적 서열의 5' 말단에 위치한 TTTN PAM 서열을 인식하여, Cas9으로 교정할 수 없었던 새로운 유전자 영역에 접근이 가능합니다.

• 점착 말단(Sticky End) 생성: 표적 DNA를 절단할 때 5' 돌출 형태의 점착 말단을 생성합니다. 이는 유전자 삽입(Knock-in) 효율을 높여 더 정확하고 다양한 유전자 교정을 가능하게 합니다.

구체적인 구현 방법

1. 조성물 구성: Cpf1 단백질(또는 이를 암호화하는 DNA)과 표적 유전자에 맞는 가이드 RNA(또는 이를 암호화하는 DNA)를 포함하는 복합체 또는 조성물 형태로 제공됩니다.

2. 세포 내 전달: 기존의 미세주입법 외에 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection) 등 다양한 방법을 사용하여 한 번에 많은 수의 세포에 효율적으로 전달할 수 있습니다.

3. 벡터 활용: Cpf1 및 crRNA를 암호화하는 DNA를 하나의 벡터 또는 별도의 벡터(예: AAV 바이러스 벡터)에 탑재하여 세포나 유기체에 전달함으로써 지속적인 발현을 유도할 수 있습니다.

4. Split-Cpf1 시스템: 크기가 큰 Cpf1 단백질을 두 개의 절단 단편으로 나누어 전달 효율을 높이는 'Split-Cpf1' 기술을 적용하여, AAV와 같은 바이러스 벡터의 패키징 한계 문제를 극복합니다.

기술의 장점

• 넓은 표적 범위: Cas9이 접근할 수 없는 유전자 영역을 표적할 수 있어 유전체 교정의 활용 범위를 확장합니다.

• 높은 정확도와 효율: 점착 말단(Sticky end) 생성으로 유전자 삽입 효율을 극대화하여 보다 정확하고 다양한 유전자 교정이 가능합니다.

• 간소화된 절차: 단일 crRNA만을 사용하므로 가이드 RNA 제작이 상대적으로 쉽고 간편합니다.

• 향상된 전달 효율: Split-Cpf1 및 전기천공법 등 효율적인 전달 방식을 채택하여 다양한 세포와 생물체에 효과적으로 기술을 적용할 수 있습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 목적은 Cpf1 기반 유전체 교정 시스템의 효율성과 특이성을 인간 세포, 마우스 배아, 식물 세포 등 다양한 진핵 유기체 환경에서 검증하는 것이었습니다. 특히, 기존 Cas9 시스템과의 성능을 비교하고, RNP(리보핵산단백질) 전달 방식 및 Split-Cpf1과 같은 새로운 전달 전략의 유효성을 평가하고자 했습니다.

실험 방법 및 과정

1. Cpf1 및 crRNA 제작: LbCpf1, AsCpf1 등 다양한 미생물에서 유래한 Cpf1 단백질을 발현하는 플라스미드와 특정 유전자(예: DNMT1, EMX1)를 표적하는 crRNA 발현 플라스미드를 제작했습니다.

2. 세포 내 전달: 제작된 플라스미드를 인간 배아 신장 세포(HEK293T)에 리포펙션(lipofection) 방법을 사용하여 전달했습니다. 또한, 정제된 Cpf1 단백질과 crRNA로 구성된 RNP 복합체를 전기천공법(electroporation)으로 마우스 배아 및 식물 원형질체에 전달했습니다.

3. 효율 분석: 유전자 전달 72시간 후, 세포로부터 유전체 DNA를 분리했습니다. 표적 부위의 염기서열 변이(Indel) 발생 빈도를 T7E1 분석 및 표적 딥 시퀀싱(Targeted deep sequencing)을 통해 정량적으로 측정하고, Cas9 시스템과 효율을 비교 분석했습니다.

4. 특이성 검증: 비표적 위치에서의 변이(Off-target effect) 발생 여부를 확인하기 위해 Digenome-seq을 수행하여 Cpf1의 genome-wide 특이성을 평가했습니다.

실험 결과

실험 결과, Cpf1 시스템은 다양한 표적 유전자에 대해 높은 유전체 교정 효율을 보였습니다. 특히 LbCpf1과 AsCpf1은 인간 세포에서 널리 사용되는 SpCas9과 유사하거나 일부 표적에서는 더 높은 변이 유발 빈도를 나타내며 그 유효성을 입증했습니다. 아래 표는 주요 표적 유전자에 대한 Cpf1과 SpCas9의 유전체 교정 효율 비교 결과입니다.

또한, Digenome-seq 분석을 통해 Cpf1이 Cas9에 비해 비표적 변이(off-target)를 현저히 적게 유발하여 매우 높은 특이성을 가짐을 확인했습니다. RNP 형태로 전달했을 때 이러한 특이성은 더욱 향상되었습니다. 이는 Cpf1 시스템이 치료 목적의 정밀한 유전체 교정에 더 안전하게 사용될 수 있음을 시사합니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 질병 치료제 개발: 안구 질환(당뇨성 망막병증, 노인성 황반변성)의 원인 유전자인 Hif1-alpha를 표적으로 하는 치료제 개발에 직접적으로 활용될 수 있습니다.

• 형질전환 동식물 개발: 특정 유전자가 제거(knock-out)되거나 삽입(knock-in)된 형질전환 유기체(동물, 식물)를 효율적으로 제작하여 기초 연구, 신약 개발 모델, 고부가가치 농축산물 생산에 이용할 수 있습니다.

• 유전자 기능 연구: 특정 유전자의 기능을 정밀하게 조작하여 생명 현상을 탐구하는 기초 과학 연구의 핵심 도구로 활용됩니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: Cpf1 시스템의 도입은 기존 유전자 가위 기술의 한계를 극복하여 유전체 교정 기술의 패러다임을 전환하고, 관련 연구 및 산업 발전을 가속화할 것입니다.

• 경제적 파급효과: 난치성 유전질환 치료제, 고기능성 종자 등 높은 부가가치를 창출하는 새로운 시장을 선점하고, 기술이전을 통해 막대한 경제적 이익을 기대할 수 있습니다. (예: 진코어의 3.5억 달러 기술수출)

• 사회적 파급효과: 기존에 치료가 어려웠던 유전 질환 환자들에게 새로운 치료 기회를 제공하고, 식량 문제 해결에 기여하는 등 인류의 삶의 질을 향상시키는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR 유전자 가위 기술 시장은 폭발적인 성장세를 보이고 있습니다. 관련 시장은 2024년 80억 4,000만 달러에서 연평균 15.7% 성장하여 2032년에는 299억 3,000만 달러에 이를 것으로 전망됩니다. 이러한 성장은 난치성 유전질환 치료제 개발, 고기능성 농축산물 개발 등 다양한 분야에서의 기술 적용이 확대되고 있기 때문입니다.(출처: KDB 산업은행)

• 2022년: 세계 CRISPR 기술 시장 규모 33억 달러 기록

• 2027년: 연평균 22.3% 성장하여 92억 달러 규모에 이를 것으로 전망

• 지역별로는 북미가 가장 큰 시장을 형성하고 있으며, 아시아-태평양 지역이 가장 높은 성장률을 보일 것으로 예상됩니다.

주요 플레이어 및 경쟁 환경

유전자 가위 기술 시장은 원천 기술을 보유한 소수의 바이오테크 기업들이 주도하고 있으며, 이들은 글로벌 제약사 및 종자 회사와의 파트너십을 통해 사업을 확장하고 있습니다. UC Berkeley와 Broad Institute 간의 특허 분쟁이 시장의 불확실성을 높이고 있지만, 기술 개발 및 상용화 경쟁은 더욱 치열해지고 있습니다.(출처: 바이오타임즈, GERC)

산업 동인 및 기회 요인

1. 치료 패러다임의 전환: 희귀·난치성 유전질환에 대한 근본적인 치료 가능성을 제시하면서 제약·바이오 산업의 성장을 견인하고 있습니다.

2. 규제 환경 변화: 미국, 일본 등 주요 국가에서 유전자 교정 기술이 적용된 농산물에 대한 규제가 완화되는 추세로, 농업 및 식품 분야에서의 상업화가 가속화될 전망입니다.(출처: 한국생명공학육종학회지)

3. 기술 발전 및 비용 감소: Cpf1과 같은 차세대 유전자 가위 기술의 등장과 염기서열 분석 비용의 감소는 기술 접근성을 높여 중소기업 및 스타트업의 시장 진입을 촉진하고 있습니다.