발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존 유전체 교정 기술: 유전체 교정 동물 및 식물 제작은 오랜 시간과 노력이 필요하며, 표적 유전자마다 별도의 시약 제작이 필요하여 어려움이 많았습니다.

• CRISPR-Cas9 시스템의 한계: 널리 사용되는 Type II CRISPR-Cas9 시스템은 여러 장점에도 불구하고 명확한 한계를 가지고 있습니다.

• PAM 서열 의존성: 표적 DNA의 3' 말단에 특정 PAM 서열(NGG)이 반드시 존재해야 하므로, 이 서열이 없는 유전자 부위는 교정이 불가능합니다.

• 절단 방식의 한계: DNA 이중 가닥을 동일한 위치에서 절단하는 'blunt end' 방식은 유전자 제거(knock-out) 효율은 높지만, 정교한 유전자 삽입(knock-in) 효율은 낮습니다.

• 전달 방식의 비효율성: 배아에 Microinjection(미세주입법)으로 주입하는 방식은 시간이 오래 걸리고, 짧은 시간 동안만 특정 세포 단계가 유지되는 배아에 적용하기에는 기술적 장애가 존재합니다.

기술의 필요성

• 기존 CRISPR-Cas9 시스템의 한계를 극복하고, 이를 대체할 수 있는 더 효율적이고 정교한 유전자 교정 기술의 개발이 시급합니다.

• 특히, 유전자 가위 복합체(RNP)를 대량의 세포에 빠르고 효과적으로 전달할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구됩니다.

구현 방법

기술의 원리

본 기술은 기존의 Cas9 시스템의 단점을 보완하는 Type V CRISPR 시스템 단백질인 Cpf1을 이용한 유전체 교정 기술입니다. Cpf1은 Cas9과 유사하게 가이드 RNA(crRNA)와 결합하여 표적 유전자를 절단하지만, 작동 방식에서 다음과 같은 주요 차이점을 가집니다.

• 단일 가이드 RNA 사용: Cpf1은 Cas9과 달리 tracrRNA 없이 하나의 crRNA만으로 작동하여, 인위적으로 두 RNA를 합친 sgRNA를 제작할 필요가 없습니다.

• 다른 PAM 서열 인식: 표적 서열의 5' 말단에 위치한 티민(T)이 풍부한 PAM 서열(TTN 또는 TTTN)을 인식하여 Cas9이 표적할 수 없는 영역도 교정이 가능합니다.

• 점착 말단(Sticky End) 생성: 표적 DNA 절단 시, 양쪽 가닥을 서로 다른 위치에서 잘라 5' 돌출부(overhang)를 가진 점착 말단을 생성합니다. 이는 유전자 삽입(knock-in) 시 보다 정확하고 다양한 유전자 교정을 가능하게 합니다.

구체적인 구현 방법

1. 조성물 구성: 기술의 핵심은 Cpf1 단백질(또는 이를 암호화하는 DNA)과 표적 유전자를 지정하는 가이드 RNA(crRNA 또는 이를 암호화하는 DNA)를 포함하는 복합체입니다.

2. 적용 대상: 동물(포유류 등), 식물(벼, 콩 등), 균류 등 다양한 진핵 유기체의 세포 및 개체에 적용 가능합니다.

3. 세포 내 전달 방법: 기존의 미세주입법 외에, 한 번에 많은 수의 세포에 전달 가능한 전기천공법(electroporation)이나 리포펙션(lipofection) 방식을 사용하여 효율성을 크게 높였습니다.

다양한 미생물에서 유래한 Cpf1 단백질을 활용하여 적용 범위를 넓혔습니다. 대표적인 Cpf1 단백질의 유래 정보는 아래 표와 같습니다.

또한, 각 Cpf1 단백질에 맞춰 최적화된 가이드 RNA(crRNA) 서열을 사용하여 교정의 정확도를 높였습니다.

기술의 장점

• 확장된 표적 범위: Cas9이 인식하지 못하는 PAM 서열을 표적할 수 있어 유전체 교정의 적용 범위가 넓습니다.

• 향상된 정확성 및 효율성: 점착 말단(Sticky end) 생성으로 인해 유전자 삽입(Knock-in) 효율이 높아져 보다 정교하고 다양한 유전자 변형이 가능합니다.

• 제작의 용이성: 하나의 짧은 crRNA만을 사용하므로 가이드 RNA 제작이 상대적으로 쉽고 경제적입니다.

• 높은 특이성: 실험 결과, Cas9에 비해 비표적 위치에서 변이를 일으키는 'Off-target' 효과가 현저히 낮아 안전성이 높습니다.

• 효율적인 전달 시스템: 전기천공법 등을 이용한 RNP 전달 방식을 통해 대량의 세포 및 배아에 유전자 가위를 효율적으로 전달할 수 있습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 목적은 Cpf1 시스템이 실제로 동물, 식물 등 다양한 진핵 세포에서 효과적으로 유전체 교정을 수행할 수 있는지 검증하고, 기존 Cas9 시스템과의 효율성 및 특이성을 비교 분석하는 데 있습니다. 또한, 미세주입법, 전기천공법, 리포펙션 등 다양한 전달 방법의 효율을 평가하여 본 기술의 실용화 가능성을 입증하고자 했습니다.

실험 방법 및 과정

1. Cpf1 단백질 및 RNP 제작: AsCpf1, LbCpf1 등 다양한 Cpf1 단백질을 발현 및 정제하고, 표적 유전자에 맞는 crRNA와 결합하여 리보핵산단백질(RNP) 복합체를 준비했습니다.

2. 동물 세포 및 배아 실험: HEK293T 인간 세포주 및 마우스 배아(embryo)에 Cpf1 RNP를 미세주입법과 전기천공법으로 전달하여 유전체 교정 효율을 측정했습니다.

3. 식물 세포 실험: 콩(Soybean)의 원형질체(protoplast)에 PEG 매개 방식으로 Cpf1 RNP를 전달하여 FAD2 유전자의 교정을 시도했습니다.

4. 효율 및 특이성 분석: T7E1 assay, Targeted Deep Sequencing을 통해 유전자 변이(Indel) 빈도를 측정하여 교정 효율을 정량화하고, Digenome-seq 기법으로 유전체 전반의 비표적(off-target) 효과를 분석하여 특이성을 평가했습니다.

실험 결과

실험 결과, Cpf1 시스템은 인간 세포, 마우스 배아, 식물 세포 등 다양한 진핵생물에서 성공적으로 유전체 교정을 유도했습니다. 특히 HEK293T 세포에서 여러 표적 유전자에 대한 교정 효율을 SpCas9과 비교했을 때, AsCpf1과 LbCpf1 모두 대등하거나 특정 표적에서 더 높은 활성을 보이는 등 매우 효과적임을 확인했습니다.

또한, Digenome-seq 분석을 통해 LbCpf1과 AsCpf1은 SpCas9에 비해 유전체 전반에서 비표적 절단 부위가 현저히 적게 나타나, 매우 높은 특이성(specificity)을 가짐을 입증했습니다. 이는 Cpf1 기술이 더 안전한 유전자 교정 도구로 사용될 수 있음을 시사합니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 형질전환 동식물 개발: 근육량이 많은 '수퍼근육 돼지', 갈변하지 않는 버섯, 특정 지방산 조성이 변경된 콩(FAD2 유전자 교정) 등 고부가가치 농축산물 개발에 활용할 수 있습니다.

• 유전질환 치료제 개발: 당뇨성 망막병증이나 노인성 황반변성과 같은 안구 질환의 원인 유전자(예: Hif1-alpha)를 표적하여 질병의 진행을 억제하거나 치료하는 유전자 치료제 개발에 적용 가능합니다.

• 기초 생명과학 연구: 특정 유전자의 기능을 연구하기 위해 유전자를 제거(knock-out)하거나 변형시키는 연구에 Cas9과 상호보완적으로 사용될 수 있는 핵심 도구로 활용됩니다.

• 분할 Cpf1 (Split-Cpf1) 시스템 응용: 단백질 크기가 커서 전달이 어려운 AAV 벡터 등의 한계를 극복하기 위해 Cpf1을 두 조각으로 나눠 특정 신호(예: 라파마이신)에 의해서만 작동하도록 제어하는 시스템을 구축하여, 유전자 치료의 정밀도와 안전성을 높일 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 우위 확보: 기존 Cas9 기술의 한계를 극복하고 더 넓은 범위의 유전자를 정교하게 교정할 수 있어, 차세대 유전자 가위 기술 시장에서 경쟁 우위를 확보할 수 있습니다.

• 경제적 가치 창출: 유전자 치료제, 고기능성 종자 개발 등 다양한 산업 분야에 적용되어 높은 경제적 부가가치를 창출할 것으로 기대됩니다.

• 사회적 문제 해결 기여: 난치병 치료, 식량 문제 해결 등 인류가 직면한 다양한 사회적 문제 해결에 기여할 수 있는 핵심 플랫폼 기술로 자리매김할 것입니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

유전자 가위 기술, 특히 CRISPR 기반 기술 시장은 폭발적인 성장세를 보이고 있습니다. 글로벌 크리스퍼 시장은 2014년 약 2억 달러 규모에서 2022년에는 23억 달러 규모로 10배 이상 확대될 것으로 전망될 만큼 가파른 성장 곡선을 그리고 있습니다. (출처)

• 2010년부터 2014년까지 유전자 가위 기술의 연평균 성장률(CAGR)은 41%에 달했으며, 3세대 기술(CRISPR)의 경우 136%라는 경이로운 성장률을 기록했습니다. (출처)

• Cpf1과 같은 새로운 유전자 가위 기술이 계속해서 개발되고 있어, CRISPR 기술의 응용 범위와 시장 규모는 더욱 확대될 것으로 예상됩니다. (출처)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

CRISPR 기술의 상업화가 빠르게 진행되면서, 기술 개발 및 특허 확보를 위한 글로벌 기업들의 경쟁이 치열합니다. 주요 기업들은 나스닥 상장을 통해 수천억 원의 자금을 확보하며 치료제 및 제품 개발에 박차를 가하고 있습니다. (출처)

산업 동인 및 기회 요인

1. 농작물 상용화 규제 완화: 미국 농무부(USDA)가 유전자 가위 기술로 개발된 버섯을 GMO로 규제하지 않기로 결정하면서, 농업 분야에서의 상업화 가능성이 크게 높아졌습니다. 이는 식량 안보 문제 해결과 함께 거대한 잠재 시장이 열렸음을 의미합니다. (출처)

2. 기술의 혁신성과 효율성: 유전자 편집 기술은 작물 유전체의 특정 위치에서 원하는 변이를 저비용으로 빠르고 효율적으로 유도할 수 있는 혁신적인 방법으로 인정받고 있습니다. (출처)

3. 플랫폼 기술의 다각화: Cpf1 외에도 Cas13, Cas14, 초소형 유전자 가위 등 다양한 유형의 유전자 가위가 개발되면서, 기존 기술의 한계를 보완하고 적용 가능한 질병 및 작물의 범위가 넓어지고 있습니다. (출처)