발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 현재 널리 사용되는 유전자 가위 기술인 CRISPR-Cas9 시스템은 박테리아의 면역 체계에서 유래한 기술로, 특정 유전자를 효율적으로 절단할 수 있어 다양한 분야에서 활용되고 있습니다.

• 대표적인 S. pyogene Cas9 (SpCas9) 단백질은 특정 염기서열(PAM)인 NGG를 인식하고, 그로부터 3bp 앞부분을 절단하여 양쪽 가닥이 같은 길이로 잘리는 '뭉툭한 말단(blunt-end)'을 만듭니다.

• 이러한 SpCas9의 특이성은 유전자 교정의 정확성을 높이지만, 동시에 인식할 수 있는 염기서열을 제한하여 활용 범위를 좁히는 한계점을 가지고 있습니다.

기술의 필요성

• 기존 SpCas9의 한계를 극복하고 유전자 교정 기술의 활용 범위를 넓히기 위해, 다른 박테리아 종에서 새로운 특성을 가진 Cas9 단백질을 발굴하려는 연구가 필요합니다.

• 특히, 외부 유전자를 원하는 위치에 보다 효율적이고 정확하게 삽입할 수 있는 새로운 방식의 유전자 가위 기술 개발이 요구됩니다.

구현 방법

기술의 원리

본 발명은 Francisella novicida 박테리아에서 유래한 새로운 Cas9 단백질(FnCas9)을 이용한 유전체 교정 기술을 제공합니다. 이 기술의 핵심 원리는 다음과 같습니다.

• FnCas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)가 결합하여 리보핵산 단백질 복합체를 형성합니다.

• 가이드 RNA가 표적 DNA 서열을 찾아 결합하면, FnCas9 단백질이 DNA 이중 나선을 절단합니다.

• FnCas9은 기존 SpCas9과 달리, DNA 절단 시 한쪽 가닥이 더 길게 남는 '접합 말단(sticky end)'을 생성합니다. 이 접합 말단은 외부 유전자가 삽입될 때 상보적으로 결합할 수 있어 유전자 삽입(Knock-in) 효율을 크게 높입니다.

구체적인 구현 방법

1. FnCas9 단백질 발현 및 정제: FnCas9 단백질을 암호화하는 유전자를 플라스미드에 클로닝한 후, 박테리아에서 대량으로 발현시키고 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 고순도로 분리 및 정제합니다.

2. 가이드 RNA 합성: 표적 유전자 서열에 맞게 설계된 DNA 주형을 바탕으로 시험관 내 전사(In-vitro transcription) 방법을 통해 가이드 RNA를 합성합니다.

3. 세포 내 전달 및 유전체 교정: 정제된 FnCas9 단백질과 합성된 가이드 RNA를 혼합하여 리보핵산 단백질 복합체를 만듭니다. 이 복합체를 전기천공법(electroporation) 등의 방법을 통해 교정하고자 하는 세포(예: K562, HEK293 세포) 내로 직접 전달합니다.

기술의 장점

• 높은 유전자 삽입 효율: '접합 말단'을 생성하여 외부 유전자를 기존 기술보다 훨씬 정확하고 효율적으로 원하는 위치에 삽입(Knock-in)할 수 있습니다.

• 기존 기술 한계 극복: SpCas9의 PAM 서열 제한성을 극복하고, 새로운 절단 방식을 제공하여 유전체 교정의 유연성과 활용도를 높입니다.

• 다양한 세포 및 유전자 적용 가능: 인간 세포주(K562, HEK293) 및 다양한 표적 유전자(CCR5, AAVS1 등)에서 성공적으로 유전자 교정 능력을 입증하여 넓은 적용 가능성을 보여줍니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구에서는 새로 발굴한 FnCas9 단백질의 유전자 가위로서의 성능을 검증하기 위해 여러 실험을 수행했습니다. 주요 목적은 FnCas9이 표적 DNA를 인식하는 규칙(PAM 서열)과 절단 위치를 규명하고, 실제 세포 내에서 유전체 교정 및 외부 유전자 삽입이 얼마나 효율적으로 일어나는지 기존 기술과 비교 분석하는 것이었습니다.

실험 방법 및 과정

1. PAM 서열 및 절단 지점 규명: 무작위 PAM 서열을 가진 DNA 라이브러리를 제작하고, 정제된 FnCas9 복합체로 절단 반응을 일으킨 후, 차세대 염기서열 분석(NGS)을 통해 절단된 단편들을 분석하여 PAM 서열을 확인했습니다. 또한, 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 정확한 절단 위치를 분석했습니다.

2. 세포 내 유전체 교정 효율 분석: FnCas9 복합체를 인간 세포주(K562, HEK293)에 전달하고, 48~72시간 배양 후 게놈 DNA를 추출했습니다. T7E1 분석 및 차세대 염기서열 분석을 통해 표적 유전자 부위의 돌연변이(삽입/결실) 발생 빈도를 측정하여 교정 효율을 정량화했습니다.

3. 외부 유전자 삽입(Knock-in) 효율 비교: FnCas9 또는 SpCas9 복합체와 함께 특정 서열을 가진 짧은 DNA 단편(Blunt, Incorrect, Correct)을 HEK293 세포에 동시에 전달했습니다. 이후 차세대 염기서열 분석을 통해 표적 유전자에 DNA 단편이 정확하게 삽입된 비율을 측정하여 두 유전자 가위의 효율을 비교했습니다.

실험 결과

실험 결과, FnCas9은 기존 SpCas9과 동일한 'NGG' PAM 서열을 인식했지만, DNA를 절단하여 5' 말단이 돌출된 '접합 말단'을 생성하는 독특한 특성을 보였습니다. 특히 외부 유전자 삽입 실험에서 FnCas9은 SpCas9에 비해 월등히 높은 '완전한 삽입(Complete KI)' 효율을 나타냈습니다. 이는 FnCas9이 생성하는 접합 말단이 유전자 삽입 과정에서 매우 유리하게 작용함을 시사합니다.

Correct DNA 단편 사용 시 Knock-in 효율 비교

특허 명세서의 표 5를 기반으로 합니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 유전 질환 치료: 결함이 있는 유전자를 정상 유전자로 교체하거나 기능을 복구하는 유전자 치료제 개발에 활용될 수 있습니다.

• 항암 치료제 개발: 면역세포(예: T세포)의 유전자를 편집하여 암세포를 더 효과적으로 공격하도록 하는 CAR-T와 같은 세포 치료제 개발에 적용할 수 있습니다.

• 농축산 분야 품종 개량: 생산성이 높거나 특정 기능(병충해 저항성 등)이 강화된 동식물 품종을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

• 기초 연구 및 신약 개발: 특정 유전자의 기능을 연구하거나 질병 모델 동물을 제작하여 신약 후보물질을 스크리닝하는 데 기여할 수 있습니다.

기대효과

• 본 FnCas9 기술은 기존 유전자 가위 기술의 한계를 극복하고, 유전자 치료 및 생명 공학 분야에서 보다 정밀하고 효율적인 유전체 교정을 가능하게 할 것으로 기대됩니다.

• 특히, 치료 유전자나 기능성 유전자를 세포 내 원하는 위치에 정확하게 삽입하는 능력이 뛰어나, 지금까지 치료가 어려웠던 다양한 난치성 유전 질환에 대한 새로운 해법을 제시할 수 있습니다.

• 기술의 독창성과 우수성을 바탕으로 관련 분야의 기술 발전을 선도하고, 국내 바이오 산업의 글로벌 경쟁력을 강화하는 데 기여할 것입니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

글로벌 유전자 가위 기술 시장은 매우 빠른 속도로 성장하고 있습니다. 시장조사기관 프리시던스 리서치에 따르면, 세계 유전자 가위 시장 규모는 2024년 80억 4,000만 달러에서 연평균 15.7% 성장하여 2032년에는 299억 3,000만 달러에 이를 것으로 전망됩니다. (출처: 바이오타임즈) 이러한 성장은 CRISPR/Cas9 기술의 높은 효율성과 편의성을 바탕으로 치료제 개발, 품종 개량 등 응용 분야가 빠르게 확대되고 있기 때문입니다.

주요 플레이어 및 경쟁 환경

유전자 가위 기술 시장은 원천 기술을 보유한 기업과 이를 활용해 치료제를 개발하는 기업 간의 파트너십이 활발하게 이루어지고 있습니다. 글로벌 제약사들은 기술 도입을 위해 적극적인 투자를 진행 중이며, 국내 기업들도 고유의 기술력을 바탕으로 시장에 참여하고 있습니다.

산업 동인 및 기회 요인

1. 최초 치료제 상용화: 2023년 세계 최초의 CRISPR 기반 유전자 가위 치료제 '카스게비(Casgevy)'가 승인되면서, 기술의 상업적 잠재력이 입증되고 시장 성장의 기폭제가 되었습니다. (출처: 바이오타임즈)

2. 응용 분야의 무한한 확장: 의료 분야를 넘어 농축산, 신약 개발, 기초 연구 등 광범위한 산업에서 활용이 증가하며 새로운 시장을 창출하고 있습니다. (출처: 유진투자증권 리포트)

3. 지속적인 투자 및 기술 개발: 비표적 절단(off-target) 위험을 줄이고 효율을 높이는 등 기술적 단점을 보완하기 위한 연구 개발이 지속되고 있으며, 이는 기술의 안정성과 신뢰도를 높여 시장 확대를 이끌고 있습니다.