발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• CRISPR-Cas 시스템은 박테리아와 고세균의 외부 유전물질에 대한 면역 방어 기작입니다.

• 가이드 RNA와 Cas 단백질을 이용하여 특정 DNA 또는 RNA 서열을 정교하게 절단하는 원리를 가집니다.

• 현재 가장 널리 사용되는 크리스퍼 유전자 가위는 S. pyogenes에서 유래한 CRISPR-Cas9 시스템입니다.

• 기존 Cas9 시스템은 표적 서열 주변에 특정 염기서열인 5'-NGG PAM 서열이 반드시 존재해야만 작동하여, 적용 가능한 유전자 영역이 제한되는 한계가 있습니다.

기술의 필요성

• 기존 Cas9 시스템의 PAM 서열 제한성을 극복하고 유전자 교정의 범위를 확장하기 위해, 다른 미생물 종에 존재하는 새로운 CRISPR 시스템을 발굴하고 활용할 필요가 있습니다.

• 이를 통해 보다 다양하고 효율적인 신형 유전자 가위를 확보하여, 기초 연구부터 치료제 개발에 이르기까지 유전체 교정 기술 플랫폼 전체를 확장하는 것이 중요합니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 C2c1 엔도뉴클레아제를 이용한 새로운 유전체 교정 기술입니다.

• 최근 발견된 Type VB CRISPR-Cas 시스템인 C2c1-CRISPR 시스템을 활용하여, 기존 Cas9의 한계를 극복합니다.

• 핵심 구성요소는 C2c1 단백질과 표적 유전자를 찾아가는 가이드 RNA(sgRNA)이며, 대표적으로 Alicyclobacillus acidoterrestris에서 유래한 AacC2c1 단백질을 사용합니다.

구체적인 구현 방법

1. C2c1 단백질과 가이드 RNA를 암호화하는 유전자를 포함한 발현 벡터 형태의 유전체 교정용 조성물을 제작합니다.

2. 제작된 조성물을 리포펙션, 전기천공 등의 방법을 통해 인간 세포를 포함한 다양한 진핵 세포 또는 유기체 내로 도입합니다.

3. 세포 내에서 발현된 C2c1-가이드 RNA 복합체가 표적 DNA 서열로 이동하여 인식하고, 이중나선을 절단하여 유전자 교정을 유도합니다.

4. 이 과정을 통해 특정 유전자가 변형된 세포 또는 유기체를 생산합니다.

기술의 장점

• PAM 서열 확장: 기존 Cas9 시스템의 'NGG' PAM 서열 대신 '5'-TTN' PAM 서열을 인식하여, 유전자 교정이 가능한 표적 범위를 크게 확장합니다.

• 점착 말단(Sticky End) 생성: DNA 이중나선을 자를 때, 양 끝이 비대칭적인 '점착 말단'을 생성합니다. 이는 새로운 유전자를 삽입하는 등의 정교한 유전자 편집에 더 유리할 수 있습니다.

• 인간 세포 적용 가능: 고온 환경에서 서식하는 박테리아에서 유래했음에도 불구하고, 인간 세포 배양 온도인 37℃에서도 효과적으로 작동하는 것을 실험적으로 증명했습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 실험은 \Alicyclobacillus acidoterrestris\에서 유래한 AacC2c1-CRISPR 시스템이 인간 세포 내에서 실제로 유전자를 교정할 수 있는지, 그리고 그 효율성을 정량적으로 검증하는 것을 목적으로 합니다.

실험 방법 및 과정

1. 벡터 제작: 인간 세포에서 발현 가능한 AacC2c1 발현 벡터와, 표적 유전자(HPRT1, CCR5, DNMT1)를 겨냥하는 sgRNA 발현 벡터를 각각 제작했습니다.

2. 세포 실험: 제작된 벡터들을 Hela 세포와 HEK293T 세포에 \lipofectamine\ 시약을 사용하여 전달했습니다.

3. 유전체 분석: 벡터 전달 72시간 후 세포로부터 유전체 DNA를 추출하고, 표적 부위의 염기서열을 \Targeted deep sequencing\ 기법으로 분석하여 Indel(염기서열 삽입/결실) 발생 빈도를 측정했습니다.

4. 표현형 분석: HPRT1 유전자가 성공적으로 파괴된 세포를 선별하기 위해 6-TG(6-thioguanine) 약물을 처리한 후 살아남은 세포 콜로니를 \crystal violet staining\으로 염색하여 확인했습니다.

실험 결과

실험 결과, AacC2c1 시스템은 Hela 세포와 HEK293T 세포 모두에서 성공적으로 유전자를 교정했습니다. 특히 HPRT1 유전자의 특정 표적 서열(HPRT1-TS5)에 대해서는 HEK293T 세포에서 최대 17%의 높은 Indel 효율을 보여주며, 인간 세포 내에서의 우수한 작동 성능을 입증했습니다.

또한, HPRT1 유전자 기능이 손상된 세포를 확인하는 표현형 분석에서도 유전체 분석 결과와 일치하게 HPRT1-TS2와 HPRT1-TS5 처리군에서 많은 세포 콜로니가 형성되어, AacC2c1 시스템이 실제로 세포 기능에 영향을 미칠 수준으로 작동함을 확인했습니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 유전자 치료제 개발: 확장된 PAM 서열 인식 능력을 바탕으로 기존 기술로 접근이 어려웠던 다양한 유전 질환의 치료제 개발에 활용될 수 있습니다.

• 고부가가치 동식물 개발: 점착 말단 생성 특징을 이용하여 특정 유전자를 보다 정교하게 삽입한 질병 저항성 작물, 기능성 가축 등 개발에 적용할 수 있습니다.

• 기초 생명과학 연구: 다양한 유전체 영역에 대한 접근성을 높여, 특정 유전자의 기능을 밝히는 기초 연구의 핵심 도구로 사용될 수 있습니다.

기대효과

• 유전체 편집 플랫폼 확장: CRISPR 기술의 적용 가능 범위를 넓혀 관련 연구 및 바이오 산업 전반의 발전에 기여합니다.

• 신규 유전자가위 확보: 인간 세포 환경에 더 최적화된(mesophilic) 박테리아에서 유래한 C2c1 시스템을 발굴할 경우, 월등히 높은 효율을 갖는 차세대 유전자가위 확보가 기대됩니다.

• 기술 경쟁력 강화: 기존 Cas9 기술의 한계를 보완하는 대체재이자 보완재로서, 특허 포트폴리오를 강화하고 글로벌 기술 경쟁에서 우위를 선점할 수 있습니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

유전자 가위 기술 시장은 3세대 기술인 CRISPR/Cas9을 중심으로 폭발적인 성장을 거듭하고 있습니다. 세계 CRISPR 기술 유전자 편집 시장은 2022년 33억 달러에서 연평균 22.3% 성장하여 2027년에는 92억 달러 규모에 이를 것으로 전망됩니다.

• 지역별로는 북미가 전체 시장의 약 40.5%를 차지하며 가장 큰 비중을 보이고 있으며, 아시아-태평양 지역이 가장 높은 성장률을 보일 것으로 예상됩니다.

• 초기에는 대학 및 연구소의 연구개발 비중이 높았으나, 치료제 출시 및 상업화가 본격화되면서 바이오텍과 글로벌 제약사 등 기업의 비중이 빠르게 증가할 전망입니다.

주요 플레이어 및 경쟁 환경

CRISPR 원천 기술은 소수의 연구 그룹 및 기업이 보유하고 있으며, 이들을 중심으로 기술 패권 경쟁 및 협력이 동시에 이루어지고 있습니다.

산업 동인 및 기회 요인

1. 기술의 효율성 및 편의성: 3세대 CRISPR 기술은 기존 1, 2세대 기술에 비해 저비용으로 설계 및 사용이 간편하여 기술 확산의 핵심 동력으로 작용합니다.

2. 광범위한 적용 분야: 난치성 유전질환 치료뿐만 아니라 농·축산업 품종 개량, 기초 연구, 멸종 동물 복원 등 다양한 산업으로 활용처가 무궁무진하게 확대되고 있습니다.

3. 우호적인 규제 환경: 미국, 일본 등 주요 국가에서 유전자 편집 기술로 개발된 농산물을 기존 GMO와 다르게 분류하는 등 규제 장벽이 점차 완화되는 추세입니다.

※ 위 시장 동향은 KDB미래전략연구소 보고서, 하나증권 리서치, 바이오타임즈 등의 자료를 종합하여 작성되었습니다.