발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• CRISPR-Cas9 유전자 가위는 박테리아의 면역 시스템에서 유래한 기술로, DNA의 특정 부위를 정교하게 잘라내 유전자를 교정하는 데 사용됩니다.

• 기존 Cas9 기술의 가장 큰 문제점은 오프 타겟(off-target) 효과입니다. 이는 목표하지 않은 DNA 부위를 절단하여 원치 않는 돌연변이나 염색체 재배열을 일으킬 수 있는 위험을 의미합니다.

• 이러한 문제를 해결하기 위해 특이성을 높인 eCas9-1.1 및 Cas9-HF1과 같은 고특이성 Cas9 변이체가 개발되었습니다. 이들은 단백질과 DNA 사이의 비특이적 상호작용을 약화시켜 오프 타겟 효과를 크게 줄입니다.

기술의 필요성

• 고특이성 Cas9 변이체는 안전성을 높였지만, 특정 조건에서 목표 DNA를 교정하는 온-타겟(on-target) 활성이 낮아지는 문제가 발생했습니다.

• 따라서, 높은 특이성을 유지하면서도 온-타겟 유전자 교정 효율을 다시 높일 수 있는 새로운 기술의 개발이 시급히 요구되었습니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 기술은 가이드 RNA(sgRNA)의 5' 말단 뉴클레오타이드와 표적 DNA 서열의 일치 여부가 고특이성 Cas9 변이체의 효율에 결정적인 역할을 한다는 사실을 최초로 발견했습니다.

• 일반적으로 sgRNA를 만들 때 사용되는 U6 프로모터는 전사를 'G(구아노신)'로 시작해야 하므로, 표적 DNA의 시작이 'G'가 아닐 경우 불일치(mismatch)가 발생하여 교정 효율이 저하됩니다.

• 이 문제를 해결하기 위해, 자가-절단 리보자임(self-cleaving ribozyme)인 해머헤드(Hammerhead) 리보자임을 sgRNA의 5' 말단에 융합했습니다. 이 리보자임이 스스로 잘려나가면서, 'G' 시작 제약 없이 표적 DNA와 완벽하게 일치하는 5' 말단을 가진 sgRNA를 생성합니다.

구체적인 구현 방법

1. sgRNA 암호화 서열의 5' 말단에 해머헤드(HH) 리보자임 서열을 융합하여 발현 벡터(플라스미드)를 구축합니다.

2. 이 벡터를 세포 내로 도입하여 전사시키면, 리보자임이 포함된 긴 형태의 pre-sgRNA가 생성됩니다.

3. 생성된 pre-sgRNA는 리보자임의 자가-절단 활성에 의해 정확한 위치에서 잘려나가며, 표적 서열과 완벽하게 일치하는 5' 말단을 가진 성숙한 sgRNA(X20 sgRNA)가 최종적으로 만들어집니다.

위 그림은 해머헤드 리보자임이 융합된 pre-sgRNA가 자가 절단을 통해 표적 DNA와 완벽히 일치하는 성숙 sgRNA로 변환되는 과정을 보여줍니다.

기술의 장점

• 온-타겟 교정 효율 극대화: 고특이성 Cas9 변이체의 저하되었던 유전자 교정 효율을 야생형(Cas9-WT) 수준으로 크게 향상시킵니다.

• 높은 특이성 유지: 교정 효율을 높이면서도 오프 타겟 효과는 여전히 낮은 수준으로 유지하여, 기술의 안전성을 확보합니다.

• 표적 부위 확장성: 5' 말단 뉴클레오타이드가 'G'가 아닌 다양한 DNA 서열을 제약 없이 표적할 수 있게 되어, 고특이성 Cas9의 활용 범위를 넓힙니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 실험의 목적은 sgRNA와 표적 DNA 간의 5' 말단 불일치가 고특이성 Cas9 변이체의 교정 효율을 저하시키는지 확인하고, 해머헤드 리보자임 시스템을 통해 생성된 '매칭된 sgRNA'가 이러한 효율 저하 문제를 해결하면서도 높은 특이성을 유지할 수 있는지 검증하는 것입니다.

실험 방법 및 과정

1. 플라스미드 구축: 고특이성 Cas9 변이체(eCas9-1.1, Cas9-HF1)와 다양한 sgRNA(gX19, gX20, HH-gX19, HH-X20)를 발현하는 플라스미드를 제작했습니다.

2. 세포 배양 및 형질감염: 인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포에 준비된 Cas9 및 sgRNA 플라스미드를 도입(형질감염)했습니다.

3. 염기서열 분석: 표적 부위의 DNA를 PCR로 증폭한 후, 차세대 염기서열 분석(NGS)을 통해 유전자 교정으로 인해 발생한 삽입/결실(Indel)의 빈도를 측정하여 교정 효율을 분석했습니다.

실험 결과

5' 말단이 불일치하는 기존 sgRNA(gX19)를 사용했을 때, 고특이성 Cas9 변이체인 eCas9-1.1과 Cas9-HF1의 유전자 교정 효율은 야생형(Cas9-WT)에 비해 현저히 낮게 나타났습니다. 특히 Cas9-HF1은 대부분의 표적 부위에서 10% 미만의 매우 낮은 활성을 보였습니다.

반면, 해머헤드 리보자임으로 제작한 '매칭된 sgRNA(HH-X20)'를 사용하자, eCas9-1.1과 Cas9-HF1의 교정 효율이 평균 69% 및 59%로 크게 향상되어 야생형 Cas9-WT와 유사한 수준을 회복했습니다. 이는 5' 말단 매칭이 효율 회복의 핵심임을 증명합니다.

가장 중요한 점은, 효율이 회복된 후에도 오프 타겟 부위에서의 돌연변이 빈도는 야생형에 비해 월등히 낮게 유지되었다는 것입니다. 이는 본 기술이 '높은 효율'과 '높은 특이성'이라는 두 마리 토끼를 모두 잡았음을 의미합니다.

HH-X20 sgRNA 사용 시 Cas9 종류에 따른 On-target 및 Off-target indel 빈도 비교

출처: 발명의 상세한 설명 중 실험 결과 부분

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 유전 질환 치료제 개발: 높은 정확도로 특정 유전자 변이를 교정해야 하는 유전 질환 치료 기술에 핵심적으로 적용될 수 있습니다.

• 정밀 신약 개발: 특정 유전자의 기능을 정밀하게 조절하여 신약 후보 물질의 효능 및 독성을 평가하는 데 활용할 수 있습니다.

• 고부가가치 동식물 개발: 농업 및 축산업 분야에서 원하는 형질을 정밀하게 도입한 품종을 개발하는 데 사용될 수 있습니다.

• 기초 생명과학 연구: 특정 유전자의 기능을 안전하고 효율적으로 연구하기 위한 필수적인 도구로 활용될 수 있습니다.

기대효과

• 유전자 교정 기술의 안전성 증대: 오프 타겟 효과를 최소화하여 유전자 치료의 임상 적용 가능성을 높이고, 안전성에 대한 우려를 해소하는 데 기여합니다.

• 기술의 범용성 확대: 기존 고특이성 Cas9 기술의 한계였던 표적 제약을 극복하여, 더욱 다양한 유전자를 대상으로 정밀한 교정을 수행할 수 있게 됩니다.

• 차세대 유전자 치료 시장 선도: 높은 효율과 안전성을 동시에 갖춘 본 기술은 관련 시장에서 강력한 기술 경쟁력을 확보하고, 차세대 유전자 치료 기술을 선도할 것으로 기대됩니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR-Cas9 기술이 포함된 글로벌 유전체 시장은 2013년 약 111억 달러에서 연평균 12.2% 성장하여 2018년에는 약 198억 달러 규모로 확대되었습니다. 이러한 성장세는 앞으로도 지속될 것으로 보입니다.

• 전 세계 정밀의료 시장은 2020년 이후 총 950조 원에 달할 것으로 전망되며, 특히 분자 진단, 바이오마커, 바이오칩 분야가 높은 성장률을 보일 것으로 예상됩니다.

• 개인 유전체 분석 시장은 대중화될 경우 2023년까지 183억 달러 이상의 규모로 성장할 것으로 전망됩니다.

• 맞춤의료 및 질병 진단·치료를 포함한 국내 시장 역시 연평균 21.6%의 높은 성장률을 보이고 있습니다.

산업 동인 및 기회 요인

1. 빅데이터와 AI 기술 발전: 유전체 정보의 빅데이터화 및 분석/활용 시장이 급격히 확대되면서 관련 기술의 수요가 증가하고 있습니다.

2. 맞춤형 정밀의료 패러다임 전환: 질병의 예방과 치료가 개인의 유전 정보에 기반한 맞춤형으로 전환되면서 유전자 교정 기술의 중요성이 부각되고 있습니다.

3. 아시아 시장의 높은 성장 잠재력: 아시아 지역은 전 세계에서 가장 높은 성장률을 보이고 있으며, 기술력이 성숙되면 폭발적인 시장 확대가 기대됩니다.

출처: 한국연구재단(NRF) 보고서