연장된 단일 가이드 RNA 및 그 용도

발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 유전자 편집 기술의 하나인 염기교정 유전자가위(Base-editor)는 DNA 이중나선을 절단하지 않고 특정 염기(C→T, A→G)를 교정할 수 있어 주목받는 기술입니다.

• 기존 기술의 한계는 염기 교정이 가능한 범위가 PAM 서열로부터 13~17번째 염기로 한정되어, 이 범위를 벗어나는 위치의 유전자는 교정이 매우 비효율적이었습니다.

기술의 필요성

• 다양한 유전 질환 치료 및 품종 개량 연구에서 기존 염기 교정 범위를 벗어난 위치의 염기 교정이 요구되었습니다.

• 따라서 기존 기술의 작동 범위를 확장하여 보다 넓은 영역의 염기를 정밀하게 교정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 대두되었습니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 염기교정 유전자가위의 표적 위치를 지정하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 5' 말단 길이를 연장하는 것을 핵심 원리로 합니다.

• 연장된 sgRNA는 표적 DNA와 결합 시 더 긴 단일 가닥 DNA를 노출시키고, 이로 인해 디아미나제(deaminase) 효소가 작동할 수 있는 영역이 넓어집니다.

• 결과적으로 염기 교정 범위가 기존의 한계를 넘어 확장되어, 이전에는 교정이 어려웠던 위치의 염기도 효율적으로 변환할 수 있게 됩니다.

구체적인 구현 방법

1. 표적 서열과 혼성화 가능한 기존 가이드 RNA(sgRNA)의 5' 말단에 뉴클레오타이드를 추가하여 '연장된 가이드 RNA'를 제작합니다.

2. 구체적으로 1~3개의 구아닌(G)과 1~10개의 뉴클레오타이드(A, T, C, G)를 추가하여 sgRNA의 길이를 21개에서 30개 뉴클레오타이드 서열(gX21~gX30)로 확장합니다.

3. 이렇게 제작된 연장된 가이드 RNA를 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제(변형 Cas9 등)와 함께 염기 교정용 조성물로 구성하여 세포에 도입합니다.

기술의 장점

• 염기 교정 범위 확장: 기존 13~17번째 염기 위치에서 18~23번째 위치까지 염기 교정 범위가 확장되었습니다.

• 교정 효율 증대: 확장된 범위에서의 교정 효율이 기존 sgRNA 대비 최대 5~60배 증가하여, 원하는 돌연변이를 매우 효과적으로 유도할 수 있습니다.

• 높은 범용성: 인간세포(HEK293T), 식물(유채, 콩), 동물(생쥐) 등 다양한 진핵세포에서 기술의 효과가 검증되어 범용성이 높습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구는 sgRNA의 형태와 길이를 변형시킨 '연장된 가이드 RNA'를 사용하였을 때, 염기교정 유전자가위의 작동 범위가 실제로 확장되고 교정 효율이 증대되는지를 다양한 세포 환경에서 검증하는 것을 목적으로 합니다.

실험 방법 및 과정

1. 인간세포주(HEK293T) 실험: 다양한 길이의 연장된 sgRNA(gX20, gX21, gX22 등)를 ABE 및 CBE 염기교정효소와 함께 세포에 도입하고, deep-sequencing을 통해 염기 치환 활성을 염기 위치별로 측정했습니다.

2. 식물세포(유채, 콩) 실험: gX19와 gX20 sgRNA를 AID2 염기교정효소와 함께 각 식물의 원형질체(protoplast)에 도입하여 ALS 유전자의 특정 위치에서 염기 치환 효율을 비교 분석했습니다.

3. 동물(생쥐) 실험: Tyrosinase 유전자 변이(H420R)를 유도하기 위해 gX19, gX20, gX21 sgRNA를 ABE mRNA와 함께 생쥐 배아에 미세주입한 후, 발생 단계에서 염기 치환 활성을 분석하고 실제 태어난 개체에서 돌연변이 도입을 확인했습니다.

실험 결과

모든 실험에서 연장된 가이드 RNA를 사용했을 때 기존 sgRNA(GX19)로는 접근이 어려웠던 18~23번째 위치의 염기에서 교정 효율이 유의미하게 증가하는 것을 확인했습니다. 특히 서로 다른 4개의 표적 위치에서 실험한 결과, 교정 효율이 최대 5~60배까지 증가하여 본 발명의 우수성을 입증했습니다.