발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존의 CRISPR 유전자 가위 기술은 특정 DNA를 절단하여 유전자를 교정하지만, 이 과정에서 의도치 않은 염기 서열의 삽입 또는 삭제(인델, Indel)이 발생할 수 있는 문제점이 있습니다.

• 특히 식물 육종 및 농업 분야에서는 인델 유발보다 특정 염기 하나만 바꾸는 점 돌연변이(point mutation)가 작물 개량에 더 중요하지만, 이를 효율적으로 유도하는 기술은 제한적이었습니다.

• 기존의 시토신 염기 편집 기술은 C/G 염기쌍을 T/A로 바꾸는 데 한정되어, 아데닌(A) 염기를 교정하는 데에는 한계가 있었습니다.

기술의 필요성

• 따라서, 식물에서 원치 않는 인델 발생 없이 특정 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 효율적이고 정교하게 변환할 수 있는 새로운 염기 교정 기술의 개발이 시급했습니다.

• 이러한 정밀한 점 돌연변이 유도 기술은 특정 아미노산 서열을 변경하거나 mRNA 스플라이싱을 조절하여 원하는 형질을 가진 작물을 개발하는 데 필수적입니다.

• 자연의 유전적 변이를 재현하고 해독하여, 기후 변화 대응 및 식량 안보에 기여할 수 있는 혁신적인 육종 기술의 기반을 마련할 필요가 있습니다.

구현 방법

기술의 원리

본 발명은 야생형 디아미네이즈(deaminase)와 변이 디아미네이즈를 융합한 단백질, 그리고 표적 특이적 뉴클레아제(Cas9 니케이즈 등)를 결합한 유전자 구조체를 핵심으로 합니다. 이 구조체는 식물 세포 내에서 다음과 같은 원리로 작동합니다.

• 표적 인식: 가이드 RNA(sgRNA)가 유전자 구조체를 교정하고자 하는 특정 DNA 서열로 정밀하게 안내합니다.

• 염기 변환: 구조체에 포함된 아데노신 디아미네이즈 효소가 표적 위치의 아데닌(A)을 이노신(I)으로 변환시킵니다. 이노신은 세포 내 복제 과정에서 구아닌(G)으로 인식됩니다.

• 정밀 교정: Cas9 니케이즈는 DNA 이중나선을 완전히 자르지 않고 한 가닥에만 흠집(nick)을 내어, 세포의 자연적인 복구 시스템이 변환된 염기를 DNA에 안정적으로 통합하도록 유도함으로써 인델 발생을 최소화합니다.

구체적인 구현 방법

1. 유전자 구조체 및 벡터 제작: 야생형 및 변이 ecTadA(아데노신 디아미네이즈)와 Cas9 니케이즈를 링커로 연결한 유전자 구조체(pcABE)를 합성합니다. 이 구조체를 식물 형질전환에 적합한 바이너리 벡터에 삽입하여 최종 벡터를 완성합니다.

2. 식물 세포 도입: 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 하거나 PEG 매개 형질감염 등의 방법을 이용해 식물 원형질체 또는 조직에 도입합니다.

3. 형질전환 식물체 선발 및 분석: 벡터가 성공적으로 도입된 세포를 선발하여 식물체로 재분화시킨 후, 딥 시퀀싱(Deep sequencing)과 같은 분자생물학적 분석을 통해 목표 유전자의 염기 서열이 의도대로 교정되었는지 확인합니다.

기술의 장점

• 높은 효율성: 애기장대에서 최대 4.7%, 유채에서 최대 8.9%의 높은 A-G 염기 변환 효율을 보였습니다.

• 정밀성 및 안전성: 의도치 않은 삽입/결실(인델) 발생 빈도가 0.1% 미만으로 매우 낮으며, 잠재적 비표적(off-target) 위치에서도 거의 활성을 보이지 않아 안전성이 높습니다.

• 표현형 유도: 단일 염기 교정만으로 아미노산 변화 또는 mRNA 미스-스플라이싱을 유도하여 개화 시기 지연, 알비노 등 실제 식물의 표현형 변화를 성공적으로 이끌어냈습니다.

• 광범위한 적용 가능성: 애기장대뿐만 아니라 주요 작물인 유채에서도 성공적으로 작동함을 확인하여 다양한 식물 종에 적용할 수 있는 잠재력을 입증했습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 실험은 새로 개발한 식물용 아데닌 염기 교정 편집기(pcABE)의 성능을 검증하는 데 목적이 있습니다. 구체적으로 애기장대(Arabidopsis)와 유채(rapeseed)를 대상으로 염기 변환 효율, 정확성, 그리고 실제 식물에서의 표현형 변화 유도 능력을 종합적으로 평가하고자 하였습니다.

실험 방법 및 과정

1. 벡터 구축: 4가지 버전의 pcABE(6.3, 7.8, 7.9, 7.10) 유전자 구조체를 Cas9 니케이즈와 함께 식물 발현용 바이너리 벡터에 클로닝하였습니다.

2. 원형질체 일시적 발현 분석: 제작된 벡터와 표적 유전자(AtALS, AtPDS, AtFT 등)용 sgRNA를 애기장대와 유채의 원형질체에 도입한 후, 72시간 뒤 게놈 DNA를 추출하여 딥 시퀀싱으로 염기 변환 효율을 분석하였습니다.

3. 안정적 형질전환체 제작: 가장 효율이 높은 pcABE7.10 벡터를 아그로박테리움 매개 형질전환법(플로랄 딥)을 이용해 애기장대에 도입하여, T1 세대 형질전환 식물체를 확보하였습니다.

4. 형질 분석: 확보된 T1 식물체의 표현형(개화 시기, 잎 색 등)을 관찰하고, 생어 시퀀싱 및 앰플리콘 딥 시퀀싱을 통해 유전자 교정 여부와 효율을 정밀하게 확인하였습니다.

실험 결과

실험 결과, 개발된 pcABE 시스템, 특히 pcABE7.10은 애기장대와 유채에서 목표 아데닌 염기를 구아닌으로 높은 효율로 변환시켰으며, 원치 않는 삽입/결실(인델)은 거의 발생하지 않았습니다. 또한, 특정 프로모터(RPS5A)를 사용했을 때 형질전환 식물에서 가장 높은 편집 효율을 보였습니다. 이러한 염기 편집은 식물의 개화 시기 지연이나 알비노 표현형 발현과 같은 실제 표현형 변화로 이어졌으며, 이는 본 기술의 유효성을 입증합니다.

• pcABE 프로토타입 효율 비교

• 프로모터에 따른 편집 효율 비교

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 고부가가치 작물 개발: 병충해 저항성, 특정 영양 성분 강화, 저장성 향상, 가뭄 등 스트레스 내성과 같은 유용한 형질을 도입한 신품종 작물을 개발할 수 있습니다.

• 육종 기간 단축: 기존의 교배 육종 방식에 비해 10~15년이 걸리던 품종 개발 기간을 3~4년으로 획기적으로 단축하여 시장 변화에 빠르게 대응할 수 있습니다.

• 기초 생명과학 연구: 특정 유전자의 기능을 정밀하게 분석하는 기능 유전체 연구(Functional genomics)의 핵심 도구로 활용될 수 있습니다.

• 식물공장 및 스마트팜 맞춤형 품종: 통제된 환경에서 생육 속도나 크기를 조절한 맞춤형 품종을 개발하여 생산성을 극대화할 수 있습니다.

기대효과

• 농업 생산성 향상: 기후 변화와 같은 불리한 환경에서도 안정적인 수확이 가능한 작물 개발을 통해 글로벌 식량 위기 해결에 기여할 수 있습니다.

• 종자 주권 확보: 글로벌 종자 기업에 대한 의존도를 낮추고, 국내 기술로 개발한 우수 품종으로 국내 종자 산업의 경쟁력을 강화하고 종자 주권을 확보할 수 있습니다.

• 미래 성장 동력 창출: 유전자 편집 기술은 농업뿐만 아니라 바이오 소재, 의약품 원료 생산 등 그린바이오 산업 전반의 기술 혁신을 이끌어 새로운 시장과 부가가치를 창출할 수 있습니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

세계 유전자 가위 및 편집 시장은 2024년 93억 달러에서 연평균 15.74% 성장하여 2034년에는 401억 달러에 이를 것으로 전망됩니다. 또한, 식물 기반 바이오 기술을 포함하는 글로벌 그린바이오 시장은 연평균 8% 성장하여 2030년에는 6조 달러를 넘어설 것으로 예상되는 등, 관련 시장의 성장 잠재력은 매우 큽니다. (출처: Precedence research, NRF)

• 유전자 편집 작물 상용화 시대: Calyxt가 2019년 세계 최초로 유전자 편집 작물(고올레산 대두유)의 상업화에 성공하며 시장의 본격적인 개화를 알렸습니다. (출처: 한국육종학회지)

• 글로벌 규제 완화 추세: 미국, 일본, 아르헨티나 등 주요 국가들이 외래 유전자가 삽입되지 않은 유전자 편집 작물을 기존 GMO 규제 대상에서 제외하면서, 기술의 상업화가 더욱 가속화될 전망입니다. (출처: 한국육종학회지)

• 국내 시장의 성장: 국내 그린바이오 산업은 2018년 이후 연평균 9.7%의 높은 성장률을 보이고 있으며, 정부도 760억 원 규모의 사업단을 발족하는 등 기술 개발 및 상업화를 적극 지원하고 있습니다. (출처: KREI, 한국육종학회지)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

글로벌 종자 및 유전자 편집 시장은 Calyxt, Corteva Agriscience와 같은 혁신 기업과 기존의 다국적 농화학 기업들이 기술 개발과 상업화를 주도하고 있습니다. 이들은 인수합병과 활발한 특허 전략을 통해 시장 지배력을 강화하는 독과점 형태를 보이고 있습니다.

글로벌 유전자 편집 작물 시장 주요 플레이어 및 경쟁 환경

산업 동인 및 기회 요인

1. 글로벌 식량 수요 증가 및 기후 변화: 2050년까지 96억 명에 이를 것으로 예상되는 인구 증가와 기후 변화는 생산성 높고 복합 환경 저항성을 가진 작물 개발의 필요성을 증대시키고 있습니다. (출처: 한국육종학회지)

2. 혁신적인 기술의 발전: CRISPR와 같은 유전자 편집 기술은 기존 육종 기술의 한계를 극복하고, 개발 기간을 획기적으로 단축시키며 정밀한 품종 개량을 가능하게 하여 시장 성장을 견인하고 있습니다. (출처: 한국식물생명공학회지)

3. 융복합 산업으로의 확장: 종자 산업은 바이오, 식품, 제약 등 다양한 산업과의 융복합을 통해 새로운 부가가치를 창출하며 그 성장 가능성이 더욱 커지고 있습니다. (출처: KISTEP 기술동향브리프)