발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존 유전체 교정 도구 (ZFN, TALEN, CRISPR 등)는 식물 세포의 소기관인 미토콘드리아와 엽록체의 DNA 서열을 교정하기에 부적합합니다. 이는 가이드 RNA를 소기관으로 전달하는 것이 어렵기 때문입니다.

• 박테리아 유래 독소인 DddAtox는 이중 나선 DNA의 시토신을 탈아미노화할 수 있지만, 세포 독성 문제로 인해 두 개의 비활성화된 분할체(split)로 나누어 사용해야 하는 제약이 따릅니다.

• 미토콘드리아 DNA 돌연변이로 인한 질병 치료 시, 기존 핵산가수분해효소는 특정 돌연변이를 교정하거나 되돌릴 수 없었습니다. 미토콘드리아 내 DNA 이중 가닥 절단 복구 메커니즘이 비효율적이기 때문입니다.

기술의 필요성

• 식물 소기관(미토콘드리아, 엽록체)의 유전자 기능 연구 및 작물 생산성, 형질 개선을 위한 효율적인 유전자 교정 도구가 필요합니다. 예를 들어, 미토콘드리아 atp6 유전자 돌연변이는 웅성불임을 유발할 수 있습니다.

• 미토콘드리아 DNA 돌연변이로 발생하는 다양한 질병 모델을 제작하고, 이를 치료할 수 있는 고효율의 미토콘드리아 염기 교정 효소 개발이 시급합니다.

• 기존 기술의 한계(독성, 전달 어려움, 부정확성)를 극복하고 비선택적 염기 교정을 줄인, 안전하고 정교한 차세대 염기 교정 기술에 대한 필요성이 증대되고 있습니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 특정 DNA 서열에 결합하는 DNA 결합 단백질(ZFP, TALE 등)과 염기를 변환하는 탈아미노효소를 융합한 단백질을 이용합니다.

• 시토신(C)을 우리딘(U)으로, 아데닌(A)을 하이포잔틴(I)으로 변환시켜 DNA 복제 과정에서 각각 C·G 염기쌍을 T·A로, A·T 염기쌍을 G·C로 교정합니다.

• DddAtox의 독성을 회피하기 위해 비활성 상태의 두 분할체로 나누어 사용하거나(분할 DdCBE), 아미노산 서열을 변형하여 독성이 없는 전장(full-length) 탈아미노효소를 개발하여 사용합니다.

구체적인 구현 방법

1. 분할 시토신 탈아미노효소 (Split-DdCBE): 독성이 있는 DddAtox를 두 개의 비활성 분할체(제1분할체, 제2분할체)로 나누고, 각각을 DNA 결합 단백질(예: TALE)에 융합합니다. 두 단백질이 표적 DNA에 근접하여 결합할 때만 탈아미노효소 활성이 나타납니다.

2. 고정밀 변이체 (HF-DdCBE): 분할된 DddAtox 반쪽들의 결합 표면에 위치한 아미노산 잔기를 치환(예: 알라닌 치환)하여, 의도하지 않은 자발적 결합을 억제하고 비표적 염기 교정(off-target)을 최소화합니다.

3. 비독성 전장 탈아미노효소 (mDdCBE): DddAtox의 양전하 아미노산을 극성이 없는 아미노산(예: GSVG 변이체)으로 치환하여 단백질 전체의 독성을 제거합니다. 이를 통해 분할할 필요 없이 단일 TALE 모듈 등과 결합하여 사용할 수 있어 전달 효율과 표적 선택의 자율성을 높입니다.

4. 아데닌 염기 교정기 (DdABE): 시토신 탈아미노효소(DddAtox) 시스템에 아데닌 탈아미노효소(TadA*)를 추가로 융합하여, C-to-T 교정뿐만 아니라 A-to-G 교정까지 가능하게 만듭니다. UGI(uracil glycosylase inhibitor) 유무에 따라 C/A 동시 교정 또는 A 선택적 교정이 가능합니다.

기술의 장점

• 안전성: DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유발하지 않아 원치 않는 삽입/결실(indel) 돌연변이 발생 위험이 매우 낮습니다. (0.4% 미만)

• 적용 범위 확장: 가이드 RNA 없이 단백질만으로 작동하여 기존 CRISPR 기술로 접근이 어려웠던 미토콘드리아, 엽록체 등 세포 소기관의 DNA 교정이 가능합니다.

• 높은 효율 및 정밀도: 핵 DNA에서 최대 60%, 미토콘드리아 DNA에서 최대 30%의 높은 교정 효율을 보이며, 전장 DddA 사용 시 표적 정확성이 향상됩니다.

• 전달 용이성: 징크 핑거 단백질(ZFP) 기반 ZFD는 TALE이나 Cas9에 비해 크기가 작아 AAV와 같은 바이러스 벡터 탑재가 용이하며, 유전자 치료제 개발에 유리합니다.

• 다양한 교정 능력: C-to-T 변환뿐만 아니라 아데닌 탈아미노효소를 융합하여 미토콘드리아 DNA에서 불가능했던 A-to-G 교정까지 가능하게 하여 교정 스펙트럼을 넓혔습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 목적은 기존 유전자 교정 기술의 한계를 극복하는 새로운 염기 교정 도구를 개발하고 그 성능을 검증하는 것입니다. 구체적으로, DNA 이중 가닥 절단 없이 핵과 미토콘드리아 DNA에서 정교하고 효율적인 C-to-T 및 A-to-G 염기 교정을 유도할 수 있는 ZFD(징크 핑거 탈아미노효소)와 DdABE(TALE-아데닌 염기 교정기) 시스템을 최적화하고, 실제 인간 세포, 동물 모델, 식물 세포에서 그 유효성과 안전성을 입증하고자 하였습니다.

실험 방법 및 과정

1. 플라스미드 제작: ZFD, mitoZFD, DdCBE, DdABE 등 다양한 염기 교정기 발현 벡터를 제작했습니다. 링커 길이, 분할 위치, DNA 결합 단백질 종류 등을 변형하여 최적의 조합을 탐색했습니다.

2. 세포 배양 및 형질감염: 인간 세포주(HEK293T, K562), 생쥐 세포주(NIH3T3), 식물 원형질체(상추, 유채)에 제작된 플라스미드 또는 mRNA를 리포펙션, 전기천공법 등으로 전달했습니다.

3. 동물 모델 제작: DdCBE를 인코딩하는 mRNA를 생쥐의 1세포기 배아에 미세주입하여 미토콘드리아 DNA에 특정 점 돌연변이를 가진 질병 모델 생쥐를 제작했습니다.

4. 염기 교정 효율 분석: 세포 및 조직에서 DNA를 추출하고, 표적 부위를 PCR로 증폭한 후 생거 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱(NGS) 기술인 표적 딥 시퀀싱을 통해 염기 교정 효율과 패턴, 오프타겟 효과를 정량적으로 분석했습니다.

실험 결과

다양한 실험을 통해 개발된 염기 교정 기술의 성능을 검증하였습니다. 특히 ZFD와 기존 TALE 기반 교정 기술인 TALE-DdCBE를 비교한 결과, ZFD가 특정 타겟에서 더 높은 효율을 보이는 등 상호 보완적인 특성을 확인했습니다. 주요 실험 결과는 아래 표와 같습니다.

mitoZFD와 TALE-DdCBE의 미토콘드리아 유전자 염기 교정 효율 비교

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 미토콘드리아 유전 질환 모델 제작: LHON, MELAS 등 미토콘드리아 DNA의 특정 점 돌연변이로 인해 발생하는 질병 모델 동물을 정교하게 제작하여 병리학적 연구 및 신약 개발에 활용할 수 있습니다.

• 차세대 유전자 치료제 개발: DNA 이중 가닥 절단 없이 안전하게 특정 염기만 교정할 수 있어, 미토콘드리아 질환을 포함한 다양한 유전 질환에 대한 근본적인 치료제 개발에 적용 가능합니다.

• 고부가가치 작물 및 식물 개발: 엽록체나 미토콘드리아 유전자를 교정하여 항생제 내성, 웅성불임(F1 종자 생산) 등 농업적으로 유용한 형질을 식물에 도입하여 신품종을 개발할 수 있습니다.

• 기초 생명과학 연구: 특정 유전자의 염기 하나를 정밀하게 바꾸어 해당 유전자의 기능을 심도 있게 연구하는 도구로 활용될 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: 세계 최초로 미토콘드리아 DNA에서 A-to-G 교정이 가능한 DdABE 기술을 확보하여, 기존 C-to-T 교정만 가능했던 기술적 한계를 돌파하고 유전자 교정의 범위를 획기적으로 확장합니다.

• 의료 및 산업적 가치 창출:これまで治療法がなかったミトコンドリア遺伝病に対する革新的な治療法開発の可能性を開き、バイオ医薬品市場で高い競争力を確保します。また、高機能性農作物の開発を通じ、種子産業における新たな市場を創出します。

• 안전성 및 편의성 증대: 비독성 전장 DddA를 이용한 단일 모듈 시스템은 기존의 분할-이량체 방식보다 작고 간단하여 AAV 벡터 전달 효율을 높이고, 잠재적인 오프타겟 효과를 줄여 치료제로서의 안전성을 크게 향상시킵니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

글로벌 유전자 편집 시장은 기술의 발전과 적용 분야 확대로 인해 빠르게 성장하고 있습니다. 2023년 50억 달러 규모에서 연평균 15% 성장하여 2028년에는 100억 달러를 넘어설 것으로 전망됩니다.

• 2023년 시장 규모: 50억 달러 (약 6조 5,600억 원) (출처)

• 2028년 예상 규모: 100억 달러 (약 13조 1,200억 원) (출처)

• 연평균 성장률(CAGR): 15% (출처)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

유전자 편집 시장은 1세대 ZFN, 2세대 TALEN을 거쳐 현재 3세대 CRISPR 기술이 시장을 주도하고 있습니다. CRISPR 기술은 전체 시장의 약 66%를 점유하고 있으며, Sangamo, Cellectis 등 초기 기술을 보유한 기업들과 CRISPR Therapeutics, 툴젠 등 3세대 기술 기업들이 치열하게 경쟁하고 있습니다.

주요 유전자 편집 기업 및 핵심 기술

산업 동인 및 기회 요인

1. 질병 유병률 증가: 암, 알츠하이머, 당뇨병 등 난치성 및 유전성 질환의 유병률 증가는 유전자 치료제 개발의 필요성을 높여 시장 성장을 견인하고 있습니다. (출처)

2. 기술 발전 및 효율성 증대: 시퀀싱 및 게놈 편집 기술의 급속한 발전은 유전자 편집의 효율성과 정확성을 높여 적용 가능한 분야를 확대시키고 있습니다. (출처)

3. 연구개발 투자 증가: 정부 및 민간 부문의 생명 과학 및 게놈 연구에 대한 투자가 지속적으로 증가하며 기술 개발 및 상용화를 촉진하고 있습니다. (출처)