발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 기존의 ZFN, TALEN, CRISPR와 같은 유전체 교정 도구들은 식물의 유전 연구와 작물 형질 개선에 크게 기여해왔습니다.

• 그러나 이러한 도구들은 식물 세포의 핵심 에너지 대사를 담당하는 소기관인 미토콘드리아와 엽록체의 DNA를 교정하는 데 한계가 있었습니다.

• 가이드 RNA(gRNA)를 소기관 내부로 정확하게 전달하는 것이 기술적으로 어렵고, 교정에 필요한 여러 구성요소를 소기관 내에서 동시에 발현시키는 것이 복잡했기 때문입니다.

기술의 필요성

• 식물 세포 소기관은 광합성 및 호흡에 필수적인 유전자들을 다수 포함하고 있어, 이 유전자들의 기능을 정밀하게 연구하고 제어하는 기술이 중요합니다.

• 소기관 DNA 교정 기술은 작물의 생산성, 영양 가치, 특정 환경에 대한 저항성 등 형질을 개선하는 데 필수적입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 유전자 교정으로 웅성불임(수컷 불임) 특성을 유도하여 종자 생산 효율을 높이거나, 엽록체 유전자 교정으로 특정 항생제 또는 제초제에 대한 내성을 부여할 수 있습니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 기존 CRISPR 시스템의 한계를 극복하기 위해 가이드 RNA(gRNA) 없이 작동하는 새로운 방식의 염기 교정 기술을 제안합니다.

• 핵심 원리는 DNA 결합 단백질(TALE 또는 ZFP), 분리된 형태의 시토신 탈아미노효소(DddAtox), 그리고 아데닌 탈아미노효소를 융합한 단백질 복합체를 이용하는 것입니다.

• 이 복합체는 세포 소기관 DNA의 특정 위치에 결합하여 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 정밀하게 교정합니다. 특히 독성을 줄이기 위해 시토신 탈아미노효소를 두 개의 비활성 조각으로 나누고, 이들이 표적 DNA 위에서만 재결합하여 활성화되도록 설계되었습니다.

구체적인 구현 방법

1. DNA 결합 단백질: 표적 DNA 서열을 정밀하게 인식하고 결합하는 역할을 합니다. 본 기술에서는 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터(TALE)를 사용합니다.

2. 분할 시토신 탈아미노효소: 박테리아 유래 효소인 DddAtox를 두 개의 비활성 분할체로 나누어 사용합니다. 각 분할체는 DNA 결합 단백질에 각각 연결되며, 표적 위치에서 두 단백질이 만나 재구성될 때만 활성을 띠게 되어 원치 않는 부위에서의 반응(off-target)을 최소화합니다.

3. 아데닌 탈아미노효소: 대장균의 TadA 효소 변이체를 사용하여 표적 위치의 아데닌(A)을 이노신(I)으로 변환하고, 이는 세포 내 DNA 복제 과정에서 최종적으로 구아닌(G)으로 인식됩니다.

4. 전달 및 발현: 이러한 융합 단백질을 코딩하는 핵산(DNA 또는 mRNA)을 식물 세포에 전달합니다. 특히 소기관 표적을 위해 엽록체 전달 펩타이드(CTP) 또는 미토콘드리아 전달 신호(MTS)를 추가하여 융합 단백질이 정확한 소기관으로 이동하도록 유도합니다.

아래는 DddAtox와 아데닌 탈아미노효소를 TALE 단백질에 결합한 염기 교정기의 모식도입니다.

기술의 장점

• 편집 범위 확장: 기존에 불가능했던 식물 세포 소기관 DNA의 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 교정하는 것이 가능해져, 유전자 교정의 범위를 획기적으로 넓혔습니다.

• 새로운 형질 개발: 엽록체 psbA 유전자 교정을 통해 새로운 방식의 제초제 저항성 작물 개발이 가능하며, 다른 소기관 유전자 교정을 통해 다양한 신품종 개발의 문을 열었습니다.

• 높은 호환성 및 안전성: 가이드 RNA 없이 단백질만으로 작동하므로, RNA 전달이 어려운 소기관에 효과적으로 적용할 수 있습니다. 또한 분할 효소 시스템을 통해 표적 특이성을 높이고 부작용 위험을 줄였습니다.

• 생산량 증대 잠재력: 광합성에 핵심적인 역할을 하는 루비스코(Rubisco) 유전자를 교정하여 광합성 효율을 조절하고, 이를 통해 식물의 바이오매스 및 생산량 증대를 기대할 수 있습니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 실험은 개발된 아데닌 염기 교정기(DdABE)의 성능을 실제 식물 세포에서 검증하는 것을 목표로 하였습니다. 구체적으로 상추(Lettuce)의 엽록체에 존재하는 특정 유전자들을 표적으로 하여, 염기 교정을 통해 유의미한 형질 변화를 유도할 수 있는지 확인하고자 하였습니다. 주요 실험 목표는 16s rRNA 유전자 교정을 통한 스펙티노마이신(Spectinomycin) 항생제 저항성 획득, 그리고 psaA 유전자의 시작 코돈(ATG) 파괴를 통한 알비노(백색) 표현형 유도 가능성을 평가하는 것이었습니다.

실험 방법 및 과정

1. 염기 교정기 제작: 표적 유전자 서열(16s rRNA, psaA)에 맞춤 설계된 TALE 단백질과 분할 DddAtox, 아데닌 탈아미노효소(AD)를 결합한 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 시험관 내에서 합성하였습니다.

2. 세포 준비: 상추 잎에서 세포벽을 제거하여 원형질체(protoplast)를 분리하였습니다.

3. mRNA 전달: 합성된 mRNA 30ug을 상추 원형질체에 PEG 매개 형질감염 방법으로 전달하였습니다.

4. 배양 및 분석: mRNA가 전달된 원형질체를 7일간 배양한 후, 일부는 직접 분석하고 일부는 추가 배양하여 캘러스(callus, 식물 조직 덩어리)를 확보했습니다. 이후 표적 부위의 DNA 서열을 분석하여 아데닌 염기 교정 효율을 정량적으로 확인하였습니다.

실험 결과

상추 원형질체에서 수행된 염기 교정 실험 결과, 표적 아데닌 염기가 성공적으로 구아닌으로 변환되었음을 확인하였으며, 그 효율은 아래 표와 같습니다. 이 결과는 본 발명의 기술이 식물 세포 소기관 내에서 효과적으로 작동함을 입증합니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 제초제 저항성 작물 개발: 엽록체의 psbA 유전자를 교정하여 아트라진(Atrazine)과 같은 특정 제초제에 저항성을 갖는 작물을 개발할 수 있습니다.

• 항생제 저항성 마커 도입: 엽록체의 16s rRNA 유전자를 교정하여 스펙티노마이신(Spectinomycin) 저항성을 부여할 수 있으며, 이는 유전자 변형 식물 선별 과정에서 유용한 마커로 활용될 수 있습니다.

• 기능성 및 신품종 작물 개발: 광합성 효율을 조절하는 루비스코(Rubisco) 유전자를 교정하여 식물의 성장 속도와 생산량을 높이거나, psaA 유전자 교정으로 알비노와 같은 특수 관상용 식물을 개발할 수 있습니다.

• 다양한 작물에 적용: 엽록체 DNA는 벼, 밀, 옥수수, 토마토, 감자 등 주요 작물 간에 상동성이 높아, 본 기술을 다양한 상업용 작물에 폭넓게 적용할 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: 식물 세포 소기관 유전자 교정 기술의 한계를 극복하고, 기존에 접근이 어려웠던 유전자들을 편집할 수 있는 새로운 플랫폼을 제공하여 관련 연구 개발을 촉진할 수 있습니다.

• 경제적 가치 창출: 생산성, 기능성, 내재해성이 향상된 고부가가치 신품종을 개발하여 종자 산업 및 농업 분야에서 높은 경제적 가치를 창출할 수 있습니다.

• 지속 가능한 농업에 기여: 제초제 사용을 최적화하고, 가혹한 환경에서도 잘 자라는 작물을 개발함으로써 화학 비료나 농약 사용을 줄이고 기후 변화에 대응하는 지속 가능한 농업 시스템 구축에 기여할 수 있습니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

CRISPR-Cas9 기술을 중심으로 한 유전자 교정(GE) 기술 시장은 폭발적인 성장세를 보이고 있습니다. 2023년 약 53억 달러 규모로 추산되는 세계 시장은 연평균 15.0%의 성장률을 기록하며 2028년에는 107억 달러에 이를 것으로 전망됩니다. 특히 농업 분야는 유전자 가위 기술을 통해 작물의 형질을 개선하려는 시도가 활발하며, 규제 완화 추세와 맞물려 상업화 가능성이 매우 높은 시장으로 평가받고 있습니다. (출처: 한국식물생명공학회지)

• 글로벌 시장 규모 (2023년): 약 53억 달러

• 예상 연평균 성장률 (CAGR): 15.0%

• 글로벌 시장 전망 (2028년): 약 107억 달러

주요 플레이어 및 경쟁 환경

현재 유전자 교정 기술 시장은 미국(42.4%)이 주도하고 있으며, 중국, 독일, 일본, 캐나다 등이 뒤를 잇고 있습니다. 한국은 학술 연구 수준에서 세계 4위를 기록할 만큼 높은 경쟁력을 보유하고 있으나, 산업화 및 시장 점유율(1.4%)은 아직 미미한 수준입니다. 전 세계적으로 총 14건의 농업용 유전자교정생물(GEO)이 상업화 승인을 받았으며, 주요 개발 형질은 아래 표와 같습니다. (출처: 한국식물생명공학회지)

산업 동인 및 기회 요인

1. 규제 환경 변화: 미국, 일본, 호주 등 주요 국가들이 외래 유전자를 삽입하지 않은 유전자 교정 작물을 기존 GMO 규제 대상에서 제외하는 추세입니다. 이러한 규제 완화는 기술 개발 및 상업화에 소요되는 시간과 비용을 크게 절감시켜 시장 성장의 핵심 동력으로 작용하고 있습니다. (출처: 한국육종학회지)

2. 높은 안전성에 대한 공감대 형성: 유전자 교정 기술은 외부 유전자를 인위적으로 삽입하는 전통적인 GMO와 달리, 해당 생물체가 본래 가지고 있는 유전 정보 내에서 정밀한 수정만을 가하기 때문에 안전성이 높다는 사회적 공감대가 형성되고 있습니다. 이는 소비자의 수용도를 높여 시장 확대에 긍정적인 영향을 미칩니다. (출처: 이데일리)

3. 식량 안보 및 지속 가능성 요구 증대: 전 세계적인 인구 증가와 기후 변화로 인해 식량 안보의 중요성이 커지고 있습니다. 유전자 교정 기술은 병충해에 강하고, 척박한 환경에서도 잘 자라며, 생산성이 높은 작물을 개발하여 이러한 문제에 대응할 수 있는 핵심 기술로 주목받고 있습니다.