발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 코로나바이러스(CoV)는 인간과 동물에 호흡기 및 소화기계 감염을 유발하는 RNA 바이러스입니다.

• 21세기 들어 SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2 등 고병원성 코로나바이러스가 출현하며 인류 건강에 심각한 위협이 되고 있습니다.

• 바이러스는 숙주 세포의 시스템을 이용하고 면역 체계를 회피하는 복잡한 전략을 사용하며, 특히 RNA와 숙주 단백질 간의 상호작용이 바이러스 증식에 핵심적인 역할을 합니다.

• 기존의 RNA-단백질 상호작용 연구 기술(예: CLIP-seq)은 단백질 중심적이거나 특정 조건에서 한계가 있어, 바이러스 전체 RNA(전사체)와 상호작용하는 단백질을 포괄적으로 분석하는 데 어려움이 있었습니다.

기술의 필요성

• 코로나바이러스의 증식과 병원성을 이해하고 효과적인 항바이러스 치료제를 개발하기 위해, 바이러스 RNA와 직접 결합하는 숙주 및 바이러스 단백질(RNA 인터액톰)을 정확히 규명할 필요가 있습니다.

• 바이러스 수명 주기를 조절하는 핵심 단백질을 발굴하면, 이를 표적으로 하는 새로운 개념의 항바이러스제 개발이 가능해집니다.

• 포괄적인 RNA 인터액톰 분석을 위한 강력하고 신뢰도 높은 프로토콜 개발이 시급합니다.

구현 방법

기술의 원리

• 본 발명은 특정 RNA와 결합하는 단백질들을 종합적으로 분석하는 RAP-MS (RNA Antisense Purification with Mass Spectrometry) 기술을 변형하여, SARS-CoV-2 바이러스의 전체 RNA(게놈 및 서브게놈 RNA)와 직접 상호작용하는 단백질 군(인터액톰)을 포괄적으로 식별합니다.

• 바이러스에 감염된 세포에 자외선(UV)을 조사하여 RNA와 단백질을 물리적으로 가교결합시킵니다.

• 이후 세포를 용해하고, 바이러스 RNA 서열에만 특이적으로 결합하는 수많은 비오틴 표지 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 바이러스 RNA-단백질 복합체만을 선택적으로 포획합니다.

• 포획된 복합체에서 단백질을 분리하여 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 분석함으로써, 바이러스 RNA와 결합하는 수많은 숙주 및 바이러스 단백질을 정확하게 동정합니다.

구체적인 구현 방법

1. RNA-단백질 가교: SARS-CoV-2 감염 세포에 254nm UV를 조사하여 RNA와 인접한 단백질 간의 공유 결합을 형성합니다.

2. 세포 용해 및 변성: DNase 처리 후, 고농도의 변성제를 포함한 용해 완충액으로 세포를 처리하여 단백질을 균질화하고 변성시킵니다.

3. RNP 복합체 포획: gRNA 특이적 프로브 풀('Probe I') 또는 gRNA/sgRNA 공통 프로브 풀('Probe II')과 같은 비오틴화된 안티센스 프로브를 사용하여 목표 RNA-단백질(RNP) 복합체를 포획합니다.

4. 분해 및 정제: 포획된 복합체에 부착된 비드를 세척한 후, 온-비드 트립신 처리를 통해 단백질을 펩타이드 조각으로 분해하고 정제합니다.

5. 질량 분석: 정제된 펩타이드 샘플을 LC-MS/MS로 분석하여 단백질을 식별하고 정량화합니다.

기술의 장점

• 포괄적 분석: 바이러스의 전체 전사체(gRNA 및 sgRNA)와 상호작용하는 단백질들을 한 번에 식별하여, 바이러스 수명 주기에 대한 폭넓은 통찰력을 제공합니다.

• 높은 특이성 및 신뢰도: 조밀하게 중첩되는 다수의 안티센스 프로브와 엄격한 변성 및 세척 조건을 통해 비특이적 결합을 최소화하고, RNA와 직접 결합하는 단백질만을 특이적으로 분석할 수 있습니다.

• 신규 항바이러스 타겟 발굴: 이 프로토콜을 통해 항바이러스 활성을 갖는 단백질(예: LARP1, TRIM25, ZC3HAV1 등)과 프로바이러스 활성을 갖는 단백질(예: EIF3A, EIF3D, CSDE1 등)을 성공적으로 발굴하였으며, 이는 새로운 치료제 개발의 직접적인 표적이 될 수 있습니다.

• 광범위한 적용 가능성: SARS-CoV-2뿐만 아니라 HCoV-OC43 등 다른 코로나바이러스에도 적용하여 보존된 숙주-바이러스 상호작용을 확인함으로써, 광범위한 항바이러스제 개발의 기반을 마련합니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 실험의 목적은 발굴된 SARS-CoV-2 RNA 인터액톰의 숙주 단백질들이 실제 바이러스 증식에 어떤 영향을 미치는지 기능적으로 검증하는 것입니다. 이를 위해 siRNA를 이용하여 특정 숙주 단백질의 발현을 억제(녹다운)한 후, 세포 내 바이러스 RNA 양의 변화를 측정하여 각 단백질의 항바이러스(antiviral) 또는 프로바이러스(proviral) 활성을 규명하고자 하였습니다.

실험 방법 및 과정

1. 인간 폐 상피세포(Calu-3)에 특정 숙주 인자를 표적하는 siRNA 또는 음성 대조군 siRNA를 처리하여 유전자 녹다운을 유도했습니다.

2. 48시간 후, 세포의 생존율을 MTT 분석을 통해 확인하여 siRNA 처리로 인한 독성이 없음을 검증했습니다.

3. siRNA가 처리된 세포에 SARS-CoV-2 바이러스를 감염시켰습니다.

4. 감염 24시간 후, 세포로부터 총 RNA를 추출했습니다.

5. RT-qPCR을 통해 바이러스 게놈 RNA(gRNA)와 서브게놈 RNA(sgRNA)의 양을 정량적으로 측정하여, 대조군 대비 바이러스 RNA 수준의 변화를 분석했습니다.

실험 결과

실험 결과, PARP12, TRIM25, ZC3HAV1 등 인터페론 자극 유전자들과 LARP1, FUBP3 등 새로운 후보 단백질들의 발현을 억제했을 때 바이러스 RNA 양이 유의미하게 증가했습니다. 이는 이들 단백질이 바이러스 증식을 억제하는 항바이러스 인자임을 의미합니다. 반면, EIF3A, EIF3D 등 일부 번역 인자의 발현을 억제했을 때는 바이러스 RNA가 감소하여, 이들이 바이러스 증식을 돕는 프로바이러스 인자임이 확인되었습니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 신규 항바이러스제 개발: 발굴된 프로바이러스 단백질(예: EIF3A, EIF3D, CSDE1)의 활성을 억제하는 소분자 화합물, 항체, siRNA 등을 개발하여 새로운 기전의 코로나19 치료제로 활용할 수 있습니다.

• 항바이러스 물질 스크리닝: 프로바이러스 단백질의 발현량을 바이오마커로 사용하여, 대량의 후보물질 라이브러리에서 코로나바이러스 억제 효과가 있는 약물을 신속하게 스크리닝하는 데 활용할 수 있습니다.

• 바이러스 저항성 증진 치료제: 항바이러스 활성이 확인된 단백질(예: LARP1, TRIM25) 자체 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 통해, 인체의 바이러스 저항성을 높이는 예방/치료제로 개발할 수 있습니다.

기대효과

• 효과적인 감염 억제: 본 발명의 조성물은 바이러스 RNA와 직접 상호작용하는 숙주 단백질을 표적으로 하므로, 바이러스 감염 초기 단계부터 증식까지 효과적으로 억제할 수 있습니다.

• 변이 바이러스 대응: 바이러스 자체보다는 감염에 필수적인 '숙주 인자'를 표적으로 하므로, 스파이크 단백질 변이 등 바이러스 변이가 발생하더라도 효과를 유지할 가능성이 높습니다.

• 광범위한 적용: SARS-CoV-2와 HCoV-OC43에서 공통으로 발견된 숙주 인자를 표적으로 할 경우, SARS-CoV-2뿐만 아니라 다른 종류의 코로나바이러스 감염증에도 적용 가능한 범용 항바이러스제 개발로 이어질 수 있습니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

코로나19 팬데믹 이후 글로벌 헬스케어 시장은 크게 성장했으며, 특히 코로나19 치료제 시장은 2020년 약 285억 달러에서 2026년 약 510억 달러 규모로 연평균 10.2% 성장할 것으로 전망됩니다.

• 글로벌 전체 항바이러스제 시장은 2023년 498억 달러에서 2032년 711억 달러 규모까지 성장할 것으로 예측됩니다. (출처)

• 엔데믹 전환에 따라 백신 시장은 축소되고, 경구용 치료제가 시장을 대체하며 성장을 주도할 것으로 보입니다. (출처)

산업 동인 및 기회 요인

1. 신종 바이러스 위협: 신종 및 변이 바이러스의 지속적인 출현으로 사전 대처 및 치료제 개발의 필요성이 증대되고 있습니다.

2. 개발 패러다임 변화: 변이 바이러스에 강한 숙주 지향(Host-directed) 치료제 개발의 필요성이 높아지고 있으며, 이는 본 발명 기술과 부합합니다. (출처)

3. 환자 편의성 증대: 주사제형보다 복용이 편리한 경구 제형 치료제(예: 팍스로비드)에 대한 선호도가 높아 효과적인 시장 침투 기회가 존재합니다. (출처)

4. 개발 효율성: 기존 약물의 새로운 용도를 찾는 약물 재창출(Drug Repurposing) 전략이 개발 기간과 비용을 단축시켜 주목받고 있습니다. (출처)

5. 기타 성장 요인: 개발도상국의 위생 환경, 고령 인구 증가, 항바이러스제에 대한 인식 향상 등이 시장 성장에 긍정적인 영향을 미칩니다. (출처)