소량 시료로 mRNA 3′말단 서열 분석 효율 높인 mTAIL-seq 개발

발명의 배경과 필요성

기술의 배경과 문제점

• 전령 RNA(mRNA)의 3′말단에 존재하는 아데닌 꼬리(poly(A) tail)는 mRNA의 안정성, 번역 효율, 세포 내 위치 등을 결정하는 핵심적인 요소입니다.
• 아데닌 꼬리의 길이는 RNA의 생성 및 소멸과 단백질 생산 조절 연구에 중요한 정보를 제공하지만, 기존 기술로는 유전자 전체 수준에서 아데닌 꼬리 길이를 정확하고 효율적으로 측정하는 데 한계가 있었습니다.
• 특히, 동물의 난모세포나 초기 배아처럼 소량의 시료만 확보 가능한 경우, 기존 방법(TAIL-seq)을 적용하기 어려웠습니다.

기술의 필요성

• mRNA의 3′말단 서열, 특히 폴리(A) 서열을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 새로운 분석법 개발이 필요했습니다.
• 적은 양의 시료로부터 더 많은 유전자의 mRNA 정보를 효율적으로 분석할 수 있는 민감도 높은 기술이 요구되었습니다.
• 시간과 비용을 절감하고 다양한 시료에 적용 가능한 효율적인 분석 프로토콜의 필요성이 대두되었습니다.

구현 방법

기술의 원리

본 발명은 기존의 꼬리서열분석법(TAIL-seq)을 개선하여 민감도를 크게 향상시킨 새로운 전령 RNA 꼬리서열분석법인 mTAIL-seq (messenger RNA TAIL-sequencing)입니다. 이 기술의 핵심 원리는 다음과 같습니다.

• mRNA의 3′말단에 바이오틴(biotin)이 부착된 3′헤어핀 어댑터를 특이적으로 연결하여 폴리(A)+ mRNA를 효율적으로 포획합니다.
• mRNA 몸통을 임의로 절단하고, 스트렙타비딘 비드를 이용해 3′말단 조각을 분리합니다.
• 분리된 조각의 5′말단에 5′어댑터를 연결한 후, 역전사 및 PCR을 통해 증폭합니다.
• 증폭된 산물을 차세대 시퀀싱(NGS)으로 분석하여 RNA의 종류를 식별하고, 폴리(A) 꼬리 길이를 포함한 3′말단 서열 정보를 정밀하게 분석합니다.

구체적인 구현 방법

1. mRNA 3'-말단에 바이오틴이 결합된 3'헤어핀 어댑터 연결
2. 어댑터가 연결된 mRNA를 RNA 분해효소(RNase)로 부분적 절단
3. 스트렙타비딘을 이용하여 절단된 mRNA를 수득하고 5'-말단 인산화 및 엔도뉴클레오리틱 절단 반응 실시
4. 결과물로부터 300-750 nt 크기의 mRNA를 정제하고 5'-말단에 5'어댑터 연결
5. RT-PCR 및 PCR을 통해 mRNA 증폭
6. 증폭 산물을 시퀀싱하여 3' 말단 서열 분석

기술의 장점

• 높은 민감도: 기존 TAIL-seq 대비 약 5배 향상된 민감도로, 수천 개의 유전자를 동시에 분석할 수 있습니다. ~1000개의 세포에 해당하는 33ng의 극소량 RNA로도 분석이 가능합니다.
• 효율성 및 비용 절감: 폴리(A)+ RNA를 특이적으로 포획하므로 비용과 시간이 많이 소요되는 rRNA 제거 단계를 생략할 수 있어 시간과 비용을 절감합니다.
• 정확성 및 재현성: 헤어핀 어댑터를 사용해 라이게이션 효율을 높여, 넓은 동적 범위의 인풋 RNA 양에 대해서도 재현성 높은 결과를 제공합니다.
• 반복 서열 분석 용이: 기존 방법으로는 분석이 어려웠던 mRNA의 호모폴리머 서열, 즉 폴리(A) 서열을 정밀하게 분석하는 데 매우 유용합니다.

실험 및 결과

실험의 목적

본 연구의 목적은 기존의 TAIL-seq 방법이 대량의 RNA(~100 μg)를 필요로 하는 한계를 극복하고, 소량의 생물학적 시료만으로도 mRNA 3' 말단 서열을 정밀하게 분석할 수 있는 고감도 기술(mTAIL-seq)을 개발하고 그 성능을 검증하는 것입니다.

실험 방법 및 과정

1. HeLa 세포 또는 초파리 샘플에서 총 RNA를 추출합니다.
2. T4 RNA 리가아제 2를 이용하여 3' 헤어핀 어댑터를 총 RNA(~1-5 μg)에 연결합니다.
3. RNase T1으로 RNA를 부분적으로 절단하고, 스트렙타비딘 비드와 반응시켜 3' 말단 조각을 포획합니다.
4. 비드 상에서 5' 인산화(PNK 반응) 및 엔도뉴클레오리틱 절단(APE1 반응)을 실시합니다.
5. 겔 전기영동을 통해 300-750 nt 크기의 RNA를 정제합니다.
6. 정제된 RNA에 5' 어댑터를 연결하고, 역전사 및 PCR을 통해 라이브러리를 증폭합니다.
7. Illumina MiSeq 플랫폼을 이용하여 시퀀싱을 수행합니다.

실험 결과

실험 결과, mTAIL-seq는 기존 TAIL-seq에 비해 현저히 개선된 성능을 보였습니다. 소량의 시료에서도 높은 민감도와 재현성을 나타냈으며, 이를 통해 초파리 난자 발생 과정에서 폴리(A) 꼬리 길이의 동적인 조절과 번역 효율 사이의 깊은 연관성을 규명할 수 있었습니다. 두 기술의 주요 차이점은 아래 표와 같습니다.

활용 방안 및 기대효과

활용 방안

• 기초 생명과학 연구: 배아 발생, 세포 분화, 암, 신경 전달 등 다양한 생명 현상에서 RNA 생성/소멸 및 단백질 생산 조절 기작을 연구하는 데 유용한 도구로 사용될 수 있습니다.
• 질병 진단 및 바이오마커 발굴: 특정 질병 상태와 관련된 mRNA의 폴리(A) 꼬리 길이 변화 패턴을 분석하여 새로운 진단 바이오마커를 발굴하는 데 기여할 수 있습니다.
• 신약 개발 및 효능 평가: 약물 처리에 따른 유전자 발현 조절, 특히 전사 후 조절(post-transcriptional regulation) 수준의 변화를 정밀하게 추적하여 신약 후보물질의 효능을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

기대효과

• 기술적 파급효과: 소량의 시료로도 유전체 수준의 정밀한 분석을 가능하게 함으로써, 기존에 연구가 어려웠던 희귀 세포나 초기 발생 단계 샘플에 대한 연구를 촉진할 것입니다.
• 경제적 파급효과: 분석 과정의 효율성 증대와 비용 절감을 통해 유전자 분석 기술의 대중화를 앞당기고, 관련 연구 및 진단 시장의 성장에 기여할 것입니다.
• 학문적 기여: 전사 후 유전자 조절에 대한 이해를 심화시키고, 생명 현상의 복잡한 네트워크를 밝히는 데 중요한 단서를 제공하여 관련 학문 분야의 발전을 이끌 것입니다.

시장 동향

시장 규모 및 성장 전망

전령 RNA(mRNA) 서열 분석 기술이 포함되는 NGS 기반 RNA 시퀀싱 시장은 기술 발전과 응용 분야 확대로 가파른 성장세를 보이고 있습니다. 글로벌 NGS 기반 RNA 시퀀싱 시장은 2022년 25억 달러에서 연평균 17.2% 성장하여 2027년에는 55억 달러에 이를 것으로 전망됩니다.(출처: MarketsandMarkets)

• RNA 분석 전체 시장은 2022년 95억 6천만 달러에서 2030년 202억 1천만 달러에 이를 것으로 예측됩니다 (연평균 성장률 10.86%).(출처: Grand View Research)
• NGS 기반 RNA 시퀀싱 시장은 2034년까지 235억 2천만 달러에 달하며, 2025년부터 2034년까지 연평균 20.1%의 높은 성장률을 보일 것으로 예상됩니다.(출처: Towards Healthcare)

주요 플레이어 및 경쟁 환경

글로벌 NGS 장비 및 시퀀싱 시장은 소수의 기술 선도 기업들이 지배하고 있습니다. 이들 기업은 혁신적인 기술력과 광범위한 제품 포트폴리오를 바탕으로 시장을 주도하고 있으며, 주요 기업은 다음과 같습니다.

산업 동인 및 기회 요인

1. 기술 발전 및 비용 감소: 3세대 시퀀싱 기술의 발전과 전체 게놈 시퀀싱 비용의 급격한 하락은 시장 성장의 핵심 동력입니다.
2. 정밀 의학 및 맞춤형 의료 수요 증가: 암을 비롯한 다양한 질병의 진단, 예후 예측, 치료법 개발에 시퀀싱 기술의 활용이 증가하며 시장 확대를 견인하고 있습니다.
3. 정부 및 민간 투자 확대: 각국 정부의 유전체학 프로젝트에 대한 자금 지원과 제약 및 생명공학 기업의 연구 개발 투자가 시장 성장을 촉진하고 있습니다.
4. 신기술 융합: 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 기술의 발전과 인공지능(AI) 및 머신러닝(ML) 기술의 접목은 데이터 분석의 정확성과 효율성을 높여 새로운 기회를 창출하고 있습니다.