기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) 유전체 교정 연구단(단장 김진수)이 시토신 염기교정효소(DdCBE)¹⁾를 이용해 식물의 엽록체 DNA와 미토콘드리아 DNA의 특정 염기를 바꾸는 데 성공했다. 식물 소기관의 DNA를 맞춤 교정한 세계 최초의 사례로서, 농작물 육종에 크게 기여할 것으로 기대된다.

엽록체와 미토콘드리아는 각각 광합성과 에너지 생성을 담당하는 식물 세포 내 소기관이다. 이들의 DNA를 교정하면 광합성 효율, 항생제 저항성 등을 조절해 농업적·유전적 가치가 높은 식물을 개발할 수 있다. 가령 미토콘드리아 DNA를 교정해 웅성불임(Male sterility)²⁾을 유도하면 수량성(단위면적 당 수확량)과 내병성을 향상시킬 수 있다.

그러나 현재 유전체 교정 기술로 널리 활용되는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9)³⁾ 로는 식물 소기관의 DNA 교정이 불가했다. 지난해 Ddda 탈아미노 효소를 이용한 새로운 염기교정효소 DdCBE가 개발되어 미토콘드리아 DNA 교정이 가능해졌다. 유전체 교정 연구단은 이전 연구에서 DdCBE를 최초로 동물에 적용하여 미토콘드리아 DNA 교정에 성공한 바 있다. 이번 연구에서는 DdCBE를 변형해 식물 엽록체 DNA와 미토콘드리아 DNA를 최대 99% 효율로 교정해냈다.

연구진은 우선 다양한 조합의 DdCBE를 상추와 유채(rapeseed) 세포에 주입하여 가장 효율이 높은 DdCBE를 선정하였다. 이를 식물 원형질체⁴⁾ 에 도입, 엽록체 DNA의 시토신(Cytosine) 염기를 티민(Thymine)으로 치환함으로써 항생제 저항성을 가진 식물 개체를 제작해냈다. DdCBE를 이용해 세계 최초로 식물 세포 소기관의 DNA를 교정한 것이다.

나아가 DdCBE DNA를 사용하지 않고 DdCBE mRNA를 세포에 직접 도입하여 염기 교정의 정확성을 높였다. mRNA는 세포 내에서 수일 내 분해되기 때문에 DdCBE mRNA를 사용하면 표적 외 염기의 불필요한 변이 발생(표적이탈)을 억제할 수 있다. 오작동을 최소화한 식물 소기관 DNA 염기 정밀교정법을 마련한 것이다.

강범창 선임연구원(제 1저자)은 “식물의 엽록체 및 미토콘드리아 DNA를 정밀하게 교정할 수 있게 됐다”며 “작물 육종 연구 및 형질 개선에 기여하여 식량 문제 해결의 새 길을 열 것으로 기대한다”고 전했다.

김진수 단장은 “엽록체 유전자에 변이를 일으켜 광합성 효율을 높일 수 있을 것”이라며 “이는 농업 생산성 증대는 물론이고 이산화탄소 저감을 통해 기후위기를 해소하는 데에도 도움이 될 것”이라고 밝혔다.

이번 연구결과는 네이쳐 플랜츠(Nature Plants, IF 13.256)에 7월 2일 0시(한국시간) 게재되었다.

[그림1] DdCBE를 이용한 식물 소기관 DNA 교정 모식도

식물세포 내로 주입한 DdCBE는 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast transit peptide, CTP)와 미토콘드리아 전달 신호 (Mitochondrial targeting signal, MTS)를 이용하여 각각 엽록체, 미토콘드리아로 전달된다. DdCBE는 기관 내 DNA의 교정 위치에서 시토신 염기를 티민으로 치환한다.

[그림2] DdCBE를 이용한 엽록체 DNA 교정 식물 제작

엽록체 16s rRNA 유전자에 DdCBE를 이용하여 시토신(C)을 티민(T)으로 교정함으로써 항생제 저항성 식물체를 제작하였다. Shoot 1, 2는 대조군과 달리 염기서열이 치환된 것을 확인할 수 있다.

1)DdCBE(DddA-derived cytosine base editor): DNA 특정 염기서열에 결합하도록 맞춤 제작된 TALE 단백질에 세균의 독소에서 유래된 DddA 탈아미노 효소를 연결하여 만든 시토신 염기교정효소. 2020년 7월, 데이비드 리우 브로드 연구소 교수팀이 이를 이용해 동물배양세포 미토콘드리아 염기교정에 최초로 성공한 사실을 학계에 보고하였다. 2021년 2월, IBS 유전체 교정 연구단은 DdCBE를 이용하여 미토콘드리아 DNA를 교정한 생쥐를 최초로 제작했다.

2)웅성불임(male sterility) :식물이 수술, 꽃가루, 혹은 웅성 생식세포를 생산을 할 수 없는 현상. 자가수분을 방지하여 수량성(단위면적 당 수확량)과 내병성이 뛰어난 잡종종자를 생산하는 데 사용된다.

3)크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9) :가이드 RNA를 이용, Cas9 단백질이 교정할 목표 DNA를 인식할 수 있도록 한다. 이 방법은 세포 핵 속의 DNA에는 잘 작동하지만, 가이드 RNA가 미토콘드리아 막을 통과하지 못해 Cas9 단백질이 내부로 전달되지 않기 때문에 미토콘드리아 DNA 교정에는 적용할 수 없다.

4)원형질체(protoplast) :세포벽을 인위적으로 제거한 세포. 단단한 세포벽이 없기 때문에 공 모양으로 되며, 터지기 쉽다. 외부로부터 DNA, 단백질 등 거대 분자를 도입시킬 수 있어 이들의 기능을 연구하는 자료로 사용된다. 다른 식물에서 유래한 두 종류의 원형질체을 융합하여 잡종을 생산하기도 한다.